小尾寒羊MYL1 基因启动子区的克隆、分析及蛋白表达

张春兰

（潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061）

肌球蛋白轻链1（Myosin Light Chain 1，MYL1）作为动物骨骼肌肌球蛋白的一员，其不同异构体的表达与动物体不同类型肌纤维的发育有关[1]。已有研究发现MYL1基因在斑马鱼的骨骼肌卫星细胞分化为快肌纤维的早期阶段表达[2]。MYL1基因对骨骼肌生长和发育也具有重要的调控作用。早期研究发现小鼠背最长肌细胞在体外培养时MYL1基因的表达量较低[3]，近年来研究发现该基因在猪[4]和鹌鹑[5]的骨骼肌肌管发育过程中高度表达，还发现随着脊尾白虾生长其肌肉组织中MYL1基因表达量逐渐增加[6]。

目前，关于MYL1基因表达调控的研究较少，尤其在羊上鲜少有报道。Ling 等[7]利用5'RACE 法克隆了猪背最长肌中MYL1启动子区，经生物信息学分析发现生肌调节因子3（MEF3）可能结合于MYL1基因的+384～+481 区从而促进其转录。前期研究[8-9]发现MYL1基因转录后在绵羊骨骼肌中有2 种可变剪接体，即MYL1a和MYL1b，且发现MYL1a和MYL1b在绵羊骨骼肌中的表达量均显著高于其他组织，且在生长速度较快的杜泊羊骨骼肌中的表达量显著高于小尾寒羊。本研究在前期工作的基础上对MYL1基因调控区进行了克隆和生物信息学分析，并对该基因编码蛋白在小尾寒羊各组织间的表达进行分析，为进一步研究其功能和调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及样品采集 实验用小尾寒羊来自山东鲁良优质肉羊科技示范有限公司。从纯种群中任意选取3只，均为雌性，11 月龄。宰杀后迅速取肝、胃、心、肺、背最长肌、脾、卵巢等组织各2～5 g，立即投入液氮保存备用。

1.2MYL1基因启动子区的克隆及特征分析

1.2.1 引物设计 将绵羊MYL1基因的2 种可变剪接体MYL1a和MYL1b的cDNA 序列（Genbank 登录号分别为KJ700419 和KJ710701）与NCBI 中的预测序列进行比对，找到序列中的起始密码子。以起始密码子上游序列为参考，经Primer Premier 5 和DNAClub 软件设计引物（F：5'-GCTCAGAGCCCATAAAGT-3'；R：5'-GGTGGACCCAGAGTGTTA-3'），并由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 扩增及测序分析 参照PCR MasterMix 试剂盒（TIANGEN，KT201）说明书，以绵羊基因组DNA为模板对MYL1基因的启动子区序列进行PCR 扩增，扩增产物以AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（AXYGEN，#0691）进行纯化回收。回收产物经上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 将所得序列用Promoter 2.0 Prediction Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/）和CpGislands（http://www.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html）分析CpG 岛；用Neural Network Promoter Prediction（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）预测启动子；并以Proscan:Version 1.7（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）和PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）对TATA box、转录起始位点（TSS）和转录因子结合位点加以分析。

1.3 蛋白表达分析 取绵羊各组织，以RIPA裂解液（Solarbio，R0010）提取总蛋白。测定蛋白浓度后，以SDS-PAGE法进行电泳分离。经电转移法转移至PVDF 膜上后以脱脂奶粉加以封闭，并以兔MYL1 多克隆一抗（RabMAB，EPR9935）孵育过夜。加入HRP 标记的山羊抗兔二抗（上海雅酶生物科技有限公司，LF102）室温孵育1 h 后加入ELC Plus 超敏发光液（Solarbio，PE0010）进行显影和拍照，并以GAPDH 蛋白的表达水平为参考对结果进行扫描和分析。

2 结果与分析

2.1 启动子区序列 琼脂糖凝胶电泳结果显示，MYL1基因启动子区的扩增条带单一，经克隆测序获得长为2 454 bp 的启动子区序列（图1）。

2.2 启动子和CpG 岛的预测 CpGislands 软件预测结果中评分越高，表示其为启动子的可能性越大。如表1所示，MYL1基因有5 个启动子，其最佳启动子位于2 102～2 152 bp 处。该序列存在2 个TATA box，分别位于2 117 bp 和898 bp 处；有2 个转录起始位点（TSS），分别位于2 085 bp 和866 bp 处。该序列无CpG 岛。

表1 MYL1 基因的启动子序列

2.3 转录因子结合位点 如表2 所示，该启动子区序列中转录因子结合位点集中于890～1 010 bp 和2 113～2 296 bp 区域，并且这2 个区域中有多个AP 和TFIID转录因子的结合位点。

表2 MYL1 基因启动子区结合的转录因子

2.4 小尾寒羊不同组织间MYL1 蛋白表达差异 如图2所示，MYL1 蛋白只有一种亚型，其分子量约为21 ku；MYL1 蛋白仅在小尾寒羊骨骼肌中表达，其他组织中均不表达。

3 讨 论

3.1MYL1基因启动子区的序列 本研究小尾寒羊MYL1基因有2 个转录起始位点，这同在猪上以RACE 法鉴定得到MYL1基因具有2 个转录起始位点的研究结果一致[7]。前期发现MYL1基因的cDNA 存在2 种可变剪接体（MYL1a和MYL1b），且不同可变剪接体在5'端存在差异[8]，与猪上发现的MYL1基因外显子5 发生可变剪接从而产生多种可变剪接体结果相一致[7]，说明哺乳动物中MYL1基因的转录方式较为多样化。本实验所得序列经分析无CpG 岛，这与在猪上发现的MYL1基因有多个CpG 岛的结果不一致[7]，可能与所用分析软件不同或不同物种间该基因的启动子区序列不同有关。

一般认为，组织特异性表达基因均具有TATA box[10]。本研究中MYL1基因有2 个TATA box，所以推测其为组织特异性表达基因。

软件分析发现，MYL1基因存在有AP 和TFIID 转录因子的多个结合位点，这与前人发现的这些转录因子对动物生长调控起着重要作用相一致[11]，MYL1基因调控位点集中于890～1 010 bp 和2 113～2 296 bp 两个区域，结合启动子分析中发现的最佳启动子位于2 102～2 152 bp 处的分析结果，为进一步分析AP 和TFIID 转录因子对2 102～2 296 bp 区域启动子区序列的调控研究奠定了基础。研究发现小鼠[12]和猪[7]MYL1基因的启动子区受到肌肉组织特异增强子元件，如MEF2、MEF3 等的调控，但本研究中未发现此类调控元件的结合位点，可能与物种有关，有待于进一步研究证明。

3.2 小尾寒羊不同组织间MYL1 蛋白的表达 前期研究发现MYL1基因在绵羊骨骼肌中的转录水平显著高于其他组织[8-9]。本实验表明MYL1 蛋白只在小尾寒羊骨骼肌中表达，在其他组织中均不表达，该结果与猪[13]、脊尾白虾[6]和斑马鱼[2]的研究结果相一致，并且与序列分析时得出的“该基因是组织特异性表达基因”的推测相一致。本实验检测到MYL1 蛋白只有1 种亚型，而前期研究发现其转录后有多种可变剪接体[8-9]，说明该基因虽然转录水平多样化，但其翻译水平是一样的。

4 结 论

本研究推测MYL1基因有多个启动子，可结合多种转录因子；该基因为绵羊骨骼肌组织特异性表达的基因；虽然其转录水平多样化，但翻译蛋白只有1 种。