外泌体在哺乳动物胚胎附植中的作用研究进展

贺艳娟，刘德武，吴珍芳，洪林君，蔡更元

（华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510642）

哺乳动物胚胎附植是妊娠中非常重要的阶段。大部分的妊娠失败是由于附植失败，如大白猪、长白猪等瘦肉型猪种有约30% 的胚胎死亡发生在附植期，是限制母猪产仔数提高的主要因素[1]。子宫腔是精子从阴道迁移至输卵管进行受精的独特场所，胚胎附植前的最后发育和附植的早期步骤都发生在这里。子宫腔中的内容物为这些生理过程的发生提供适宜的环境。胚胎附植是囊胚在子宫内进一步发育、迁移、定位并最终与子宫壁建立密切联系的过程。胚胎进入子宫腔后，胚胎与母体子宫内膜的相互作用使很多细胞因子发生功能改变，从而促进胚胎发育、子宫内膜容受性和子宫腔微环境发生同步反应[2]。

近年来，外泌体（Exosomes）作为一种新的细胞间交流媒介在胚胎-子宫内膜的信息交流中发挥着重要作用[3]。外泌体被首次命名以来的时间轴及其在胚胎附植中的作用见图1[4-12]。虽然外泌体很早被定义但外泌体在胚胎附植中的作用在近几年才刚刚开始被描述和理解。研究发现，来源于子宫内膜[13]、植入前胚胎[14]、胚胎干细胞[15]和胎盘[16]中的外泌体能够影响母体子宫环境和胚胎发育。因此，本文主要对当前应用于外泌体提取与鉴定的方法进行总结，并着重讨论不同来源外泌体中蛋白质和miRNA 对胚胎附植的影响。

1 外泌体

1.1 外泌体的介绍 外泌是直径为30～150 nm 的双层膜胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），起源于核内体（Endosome），内含核小体，不仅能与质膜相互融合，还可以将囊泡释放到细胞外空间介导细胞之间的信息交流[17-19]。胞外囊泡包括外泌体、微囊泡（直径为100～1 500 nm）和凋亡小体（直径为500～2 000 nm），这些胞外囊泡包裹着不同的载体物质，如脂质、mRNA、microRNAs、DNA 和蛋白质，这些物质的变化取决于细胞的来源和表型[20]。外泌体几乎存在于所有的体液中，如尿液、精液、脑脊液、乳液、唾液、心包液、血液和子宫腔液，并且在许多细胞培养液上清中也发现了外泌体，如人类子宫内膜上皮细胞、树突状细胞、绒毛滋养细胞以及来自胎盘的原发性滋养层细胞均可释放外泌体。

外泌体中含有丰富的蛋白质，一般分为胞内蛋白和膜蛋白，其中胞内蛋白有调节外泌体应激反应的热休克同源蛋白70（Heat Shock Cognate Protein 70，HSC70）、转运所需的内体分选复合物ESCRT 蛋白（Endosomal Sorting Complexes Required For The Transport）和细胞内源性蛋白（Alix、TSG10 和Rab 蛋白家族）等；外泌体膜蛋白有鉴别外泌体的可靠标志物——四跨膜蛋白超家族（CD63、CD81、CD9、CD82 等）、膜联蛋白、整联蛋白、磷脂酶D、神经酰胺和中性鞘磷脂酶2 等[20-22]，外泌体所含的蛋白不同，其行使的功能就会不同。

外泌体是具有脂质双分子层结构的一种胞外囊泡，因此，脂质也是外泌体的基本成分。外泌体的脂质有神经鞘磷脂（SM）、胆固醇（Chol）、磷脂酰胆碱（PC）等。其中鞘磷脂和胆固醇可以相互作用参与细胞膜的信号转导及蛋白转运等过程[23]。

外泌体内还含有大量核苷酸，如microRNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）等[24]。外泌体所包含的RNA 统称为外泌体穿梭RNA（esRNA），esRNA 通过外泌体转运与靶细胞膜融合后，释放到靶细胞基质，之后通过多种机制调控细胞的生命活动[25]。

1.2 外泌体产生机制 在细胞的核内体系统中，细胞通过内吞的方式将蛋白质、mRNA 和microRNA 等信息物质包裹形成内吞小泡，内吞小泡之间进行相互融合形成早期核内体（Early Endosomes，EEs）。之后ESCRT-0与EEs 的泛素化结合位点特异性结合，在ESCRT-I 和ESCRT-II 的催化作用下质膜内陷以出芽的方式形成小泡，通过ESCRT-III 进行剪切，使其与EEs 质膜分离形成成熟的多泡体（Multivesicular Bodies，MVBs）[26-29]。MVBs 中含有大量直径在30～150 nm 的囊泡，MVBs 通过 Rab GTPase 家族蛋白Rab27a 和Rab27b 促进靶向位点与其突触结合蛋白 4（Syna-potagmin-Like Proteins 4，Slp4）进行结合，从而与细胞膜融合将包含的囊泡释放到细胞外基质中，而这些囊泡就是外泌体[29-31]。

1.3 外泌体的生物学功能功能 外泌体已经被证实是细胞间信息交流的一种新方式，它们可以将特定的蛋白质、脂质、microRNA 和DNA 等转移到靶细胞，从而重新编码和改变靶细胞功能[32]。外泌体不仅在抗原呈递、免疫刺激和抑制活性、癌症发生与转移、细胞分化、胚胎细胞间的信号传递、脂质、RNA、DNA 转移中起着重要作用[33]，而且在血管生成[34]、免疫调节[35]和炎症[36]中均扮演了关键的角色。

2 外泌体提取与鉴定

近年来，外泌体在细胞生物学以及医学方面的研究越来越多，但在外泌体的分离与提纯方法方面还有很多不足。在细胞外囊泡的生物学领域，很多文献对微泡与外泌体的命名没有细致区分。虽然这2 种细胞外囊泡有一些共同的货物（如mRNA、miRNA、非编码RNA、DNA、胞浆蛋白和膜蛋白等），但有特异的物质和某些蛋白质被单独包装在一个亚型的囊泡中，像四跨膜蛋白超家族ESCRT 组分、TSG101 和整合素在外泌体中是特有的，KIF23、CSE1L、ARF6 和EMMPRIN 等在微泡中是特有的。外泌体的膜直径为30～150 nm，密度在碘克沙醇中为1.10～1.12 g/mL；而微泡的膜直径为100～1 500 nm，密度在碘克沙醇中为1.17～1.20 g/mL，因此可以利用选择性膜和密度梯度法将微泡和外泌体进行过滤分离。在外泌体的提取方法中超速离心法[37]、试剂盒法[38]和密度梯度离心法[39]比较受研究者青睐，在鉴定方法中研究者通常会通过电子显微镜[33]、纳米颗粒追踪分析技术[40]和蛋白质印迹[41]等方法对其进行鉴定。

3 外泌体对胚胎附植的影响

外泌体在人类、绵羊、老鼠和牛等哺乳动物的子宫腔液中存在。在胚胎附植前和胎盘发育过程中，外泌体介导的信息交流是启动妊娠的关健。研究发现，受体细胞内的生物过程可能受到其他细胞所释放的外泌体的影响，如在人的子宫内膜上皮细胞分泌的外泌体可被胚胎滋养层细胞吸收并影响其细胞功能[42]（图2）。通过外泌体蛋白质组学研究发现来源于子宫内膜和植入前胚胎来源的外泌体所携带的蛋白质中有很多与胚胎附植相关，如胚胎的迁移、黏附和侵入等生物效应。miRNA作为外泌体重要的组成部分，是近年来外泌体研究的一个热点。不同来源外泌体miRNA 可以调控子宫内膜细胞的黏附、侵袭及血管生成能力，并能调控子宫内膜细胞的增殖与凋亡[43]。因此，子宫腔液中不同来源外泌体的蛋白质和miRNA 在胚胎-母体的信息交流中非常重要。

3.1 子宫内膜来源的外泌体对胚胎附植的作用 子宫内膜上皮是一种动态组织，在发情或月经周期中随着卵巢类固醇激素的变化，其形态和功能发生特征性变化。来源于不同生理状态的子宫内膜细胞所分泌的外泌体，其所含的信息物质（蛋白质、miRNA 等）也会不同。用经过雌激素或雌激素加孕酮处理的人子宫内膜上皮细胞分离纯化外泌体并进行蛋白质组学分析，发现用激素处理后的外泌体中蛋白质组分有显著改变[5]，通过功能分析发现其差异的糖蛋白及整联蛋白与滋养层细胞的黏附、迁移、侵入和细胞外基质降解有关，而这些功能都是胚胎正常附植不可或缺的。并且这些子宫内膜上皮细胞分泌的外泌体能被胚胎滋养层细胞所吸收，并能通过黏着斑激酶（FAK）信号通路促进滋养层细胞的黏附能力。说明来源于子宫内膜上皮细胞的外泌体在胚胎附植期可以被胚胎滋养层细胞吸收并分泌特异的蛋白增强滋养层细胞与子宫内膜的黏附能力，从而促使胚胎附植。在绵羊中，Burns 等[44]研究发现，来源于母体的内源性逆转录病毒enJSRVs 可以通过子宫内膜分泌的外泌体传输到胚胎细胞，而且enJSRV 与胚胎所分泌的妊娠识别信号分子-干扰素τ在表达量上有显著的时空关联，推测enJSRVs 可能是一种母体来源的妊娠启动信号分子，通过外泌体转运到胚胎，促进胚胎分泌干扰素，从而实现母胎间的信号交流，促进胚胎附植。此外，子宫腔液中外泌体miRNAs 的表达模式妊娠与非妊娠状态下存在显著差异。在猪中，Bidarimath 等[1]在猪子宫内皮细胞系培养液上清中分离到外泌体，并证实外泌体中miRNA能够通过外泌体进入到滋养层细胞中发挥作用。因此，哺乳动物胚胎附植期子宫腔液中外泌体miRNA 和蛋白是重要的母胎信号交流因子，子宫内膜细胞可以选择性地把miRNA 和蛋白自包装进外泌体，然后主动分泌到子宫腔液中，最终miRNA 和蛋白可以通过外泌体运输到滋养层细胞发挥调控作用，从而影响胚胎附植。以上研究说明，外泌体在胚胎附植中具有非常重要的作用。

3.2 影响子宫内膜细胞外泌体分泌的因素 外泌体在子宫内膜与胚胎之间进行精准通讯，以及子宫内膜不同细胞类型之间的相互作用会受到体内和体外环境因素的刺激从而影响其功能。Braundmeier 等[45]在体外用人类子宫内膜细胞系进行研究发现，卵巢类固醇激素雌二醇和细胞因子白介素-1β调控外泌体是从子宫内膜上皮细胞分泌的。此外，作者还发现蛋白激酶C 激活剂PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）激活细胞内钙通道显著增加了含EMMPRIN 外泌体的释放。EMMPRIN是一种刺激金属蛋白酶（MMP）生成并协调细胞外基质重构的蛋白。同时，研究进一步表明子宫上皮细胞分泌含有EMMPRIN 的外泌体会刺激子宫内膜基质细胞MMP 的产生从而影响其功能[45]。从而可以得知，在体内的一些生物因子可以影响子宫内膜上皮细胞分泌外泌体并且影响子宫内膜不同类型细胞的功能。

除激素及细胞因子外，Koh 等[46]研究发现氧气含量也会影响子宫内膜来源外泌体中的有效成分。在牛子宫内膜细胞体外培养过程中发现，低氧环境下收集的外泌体数量比富氧环境中多。通过对其蛋白组学分析发现，在低氧环境中外泌体的特异蛋白质种类比富氧环境下多，其中低氧环境中的外泌体中存在金属蛋白酶域蛋白10（ADAM10）[46]。ADAM10 是一种蛋白水解酶，可以调控细胞凋亡也可以介导E-钙粘蛋白脱落影响细胞黏附和细胞迁移[47]。这表明在附植过程中当机体受到外界不良刺激时，子宫内膜间质的细胞功能及其外泌体的释放和外泌体内容物会发生改变，从而影响胚胎与子宫内膜的相互作用。以上2 个实验表明胚胎在附植过程中子宫内膜外泌体的分泌会受到来自体内或体外因素的影响从而影响自身分泌及其功能。

3.3 胚胎来源的外泌体对胚胎附植的影响 在胚胎附植过程中，除了子宫内膜能够通过分泌外泌体到子宫腔液中来调控胚胎附植外，胚胎自身也可以分泌外泌体。研究发现，胚胎分泌的外泌体可以改变子宫内膜形态及其基因表达谱，从而调控胚胎的定位与侵入促进胚胎附植[48]。这也进一步表明，子宫内膜与胚胎附植之间的交流不是一个单向过程，而是母体与胚胎之间的双向信号传递。在体外培养胚胎实验中发现，群体培养的胚胎比单独培养的胚胎发育更好，这可能是胚胎通过旁分泌影响了邻近胚胎的发育，最近研究发现外泌体在这一过程中发挥重要作用[8]。通过孤雌生殖和核移植胚胎共同培养发现，核移植胚胎从孤雌生殖胚胎的培养基中吸收外泌体，显著提高了核移植胚胎的体外发育[8]。通过对这些外泌体的分析发现，其包含有全能基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog在内的多种mRNA[8]。因此，胚胎可以利用外泌体作为一种传递方式，不仅与母体子宫内膜交流，也可以与彼此沟通。

miRNA 主要通过与靶基因3'UTR 结合，通过阻遏基因转录后的翻译或引起靶基因mRNA 的降解来发挥调节基因表达的功能，在哺乳动物中约70% 的基因表达受到miRNA 的调控，其在动物生殖器官广泛存在，与繁殖性状高度相关[49]。在对胚胎来源的外泌体研究中发现，miRNA 可以调控早期胚胎发育的生物过程。这些miRNA 被分泌到外泌体中，进入细胞外环境被细胞吸收从而影响基因表达。Kropp 等[50]通过检测培养了5～8 d 的牛胚胎中miRNA 的分泌发现，成功发育到囊胚期的胚胎与发育失败或退化的胚胎之间miRNA表达存在的差异，在退化胚胎的培养基中，miR-25、miR -302c、miR 196a2 和miR -181 表达量较高。这些研究表明，特异性miRNA 的分泌可能与胚胎的发育能力有关。因此，可以使用特异性miRNA 作为生物标志物为成功妊娠选择最优质的胚胎。

4 展 望

外泌体是一种新发现的“细胞信号”途径，近年来已被越来越多的研究者所青睐，对外泌体的研究主要集中在细胞通讯与细胞信号转导的分子机理、药物载体和生物标志物筛选3 个方面。哺乳动物胚胎的成功附植依赖于胚胎与母体子宫内膜之间的协同交流，子宫腔液中的外泌体能够行使母体与胚胎间信息传导的功能。目前的研究主要集中在子宫腔液外泌体蛋白质和miRNAs 的成分解析，及其在胚胎附植方面进行的功能性研究。外泌体的研究中还存在很多不足，如导致一个现象的发生是由外泌体中的一种成分调控还是多种成分调控；外泌体识别定位靶细胞机制；外泌体中的物质被释放到细胞质中，它们的作用是靶细胞还是靶细胞中的细胞器等。外泌体包含的货物大部分数据来源于长期传代的细胞系，很少来源于原始组织。因此，它们在体内的相关性尚不清楚。同时，子宫腔液外泌体中脂质、mRNA 等的研究还鲜有报道。另外，为了更好地了解外泌体在胚胎与母体之间发挥的信息桥梁作用，还需要进一步明确子宫腔液中胚胎来源外泌体和子宫内膜来源外泌体的区别。对以上问题的深入研究，能够进一步解析胚胎附植过程中重要的信号调控机制，这不仅能为提高家畜动物的繁殖力提供重要科学依据，也能为人类不孕不育、辅助生殖等领域的研究提供新的思路。