畜禽粪便挥发性有机物的研究进展及其在动物健康诊断应用中的潜力

石海春，刘建新，王迪铭

（浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310029）

随着《国务院办公厅关于加快推进畜禽养殖废弃物资源化利用的意见》等新文件不断实施，我国各地对环境污染的治理加强，更加重视污染源处理，对不合规范的工厂、养殖场等实行强制关闭或整改。畜牧业粪污中产生的挥发性有机物（Volatile Organic Compounds，VOCs）是周围环境空气中的主要污染成分之一，也是PM2.5 的重要前体物。随着养殖业的规模化和集约化发展，粪污堆积造成了养殖场中VOCs 大量挥发，从而造成严重的空气污染（表1）。以牛为例，1 头体重在550 kg左右的成年奶牛每天排粪30～50 kg，排尿15～25 kg[1]。假设每年成年奶牛占50%，一年奶牛排粪量总计约6 亿t，从而产生大量的VOCs。研究显示，干奶期与泌乳期奶牛粪便每头每秒产生总有机气体（Total Organic Gases，TOGs）分别为12 μg 和18 μg，其中反应有机气体（Reactive Organic Gases，ROGs）占74%～77%，TOGs 包含甲烷、ROGs 以及丙酮和丙醛，除甲烷外，另外几种气体都属于VOCs[2]。越来越多的研究发现，通过精确检测VOCs，并与动物机体健康信息进行关联可为动物健康的无损检测提供重要理论支撑。

表1 2013—2018 年度家畜存栏量[3] 万头

1 VOCs 的定义与来源

根据我国生态环境部定义，VOCs 是指在标准状态下，饱和蒸气压高于13.33 Pa，而沸点低、分子量小、常温易挥发的一系列有机物（不含甲烷）[4]。美国环境保护局（EPA）认为VOCs 是一种有机化合物，其组成物能够在常温常压的室内大气条件下蒸发[5]。美国国家研究委员会将VOCs 描述为一种在室温下容易汽化，且具有强烈的刺激性气味、毒性和致癌性的有机化合物[6]。动物粪便堆积是畜牧业生产中VOCs 生成的主要来源，因此对于以集约化为主要特点的畜牧业来说，畜禽粪便大量堆积，微生物活动会不断累积VOCs，从而使整个养殖场以及周围的环境不断恶化。

2 畜禽粪便VOCs 的危害和检测方法

目前，有关化工行业VOCs 排放造成的环境问题已经被广泛认识和报道，但有关畜禽粪便VOCs 的产生和排放对畜禽本身和长期工作在畜牧业一线的从业者的影响研究较少。同时，家畜粪便存在着极其复杂且具有极强挥发性的VOCs 混合物（表2），其主要成分为醇、醛、芳香族化合物烷烃等，提示畜禽粪便中VOCs 的研究具有潜在价值。

表2 泌乳中期奶牛ROGs 的释放[2]

2.1 VOCs 的危害特征 VOCs 是城市雾霾和光化学污染的重要来源。在对流层中，VOCs 可通过物理过程的湿沉降和干沉降去除，通过光解、与羟基（OH）自由基反应、与硝酸盐（NO3）自由基反应和与O3反应的化学过程转化[7]。在氮氧化物（NOx）和阳光的照射下，VOCs 的降解反应导致NO 转化为NO2，形成O3。在VOC/NOx比值大时，也就是受到NOx的限制时，会影响能够形成的臭氧浓度最大值；在VOC/NOx比值小时，自由基变化会影响臭氧形成的初始速率[8]。二次有机气溶胶（SOA）的生成也与VOCs 密切相关，SOA 是由VOCs 氧化后形成的气体颗粒平衡状态物质[9]。Rule 等[10]研究发现，猪粪在发酵过程中产生大量VOCs，进而形成由颗粒物质、活细菌和VOCs 组成的气溶胶，从而对工人健康状况形成威胁。

畜禽粪便储存过程中，有机质的降解可产生VOCs。例如，甲苯是一种广泛存在于家畜粪便中的VOCs[11-12]。甲苯是由苯环的一个氢原子被甲基替代后得到的一种VOCs，属于芳香族化合物。长期接触甲苯可导致神经行为受损，表现为头痛、嗜睡、记忆力下降和听力受损[13]。甲苯的神经毒性主要体现在2 个方面：①甲苯暴露可导致谷氨酸转运体功能受损，导致谷氨酸升高，从而引起一氧化氮合酶活性和一氧化氮浓度增高，最终引起海马损伤。②甲苯暴露可提高细胞内钙浓度和细胞凋亡，从而使海马受损（图1）[14]。另外，甲苯对脑、心脏、肺、肝脏、肾都有不同程度的损害。甲苯具有亲脂性，能够通过血脑屏障进入脑，故其能在肝脏、肾等脂肪较多的部位富集。当动物体发生甲苯急性中毒时，易表现为头晕、恶心并伴随体温升高和昏睡，进而转为呼吸困难、血压下降、抽搐直至死亡[15]。有研究表明，急性中毒可引起中毒性脑病，出现意识不清及精神障碍[16]。畜禽粪便中存在一定浓度的甲苯，例如，泌乳中期奶牛每头每天可产生约700 mg 甲苯（表2），当人类接触50 mg/L 甲苯就会产生轻微嗜睡和头痛现象，造成心肌受损[17]和机体氧化应激[18]。这些结果提示，畜牧一线工作者需要对畜禽粪便中的甲苯做好防护。然而，畜禽粪便产生的甲苯暴露对畜禽生理代谢和生产性能的影响仍然有待进一步探究。

粪臭素又名3-甲基吲哚，是L-色氨酸的代谢产物，具有粪臭味。在动物体内，L-色氨酸脱氨生成吲哚丙酮酸，进一步转化为吲哚，在脱羧酶作用下生成吲哚-3-乙酸后，最终转化成3-甲基吲哚。粪臭素主要在反刍动物瘤胃、单胃动物大肠等厌氧条件下由消化道微生物产生，一部分被机体吸收进入肝脏，其代谢产物由粪和尿排出，未排除的粪臭素存储于脂肪、肝脏等组织中[19]。李彩燕等[20]采用高效液相色谱法测定猪粪便细菌群作用下L-色氨酸体外代谢的发酵初始样品中，测得粪臭素含量为11.05 μmol/L。进一步研究发现，当畜禽进行粪臭素暴露时，在细胞色素P450 的作用下，产生大分子链中间体以及羟基、氨基或巯基等，使细胞膜发生脂质过氧化，进而造成细胞坏死，并造成动物的肺水肿[19]。同时，粪臭素具有可选择性肺炎球菌毒性，可造成Ⅰ-型肺细胞和细支气管上皮细胞损伤，最终导致肺气肿[19,21]。另一些研究发现，粪臭素对某些微生物（如嗜酸乳杆菌、带纤毛的原生菌等）存在抑制作用[22]，从而影响动物对营养物质的消化，提示粪臭素对消化道微生物菌群和功能具有重要调控作用。上述结果表明，当畜牧业从业者和畜禽暴露于甲苯、粪臭素等粪便VOCs 时，机体代谢和健康状况存在潜在风险。

2.2 VOCs 的主要检测方法 VOCs 对环境以及人类健康等的影响越来越受到人们的重视，所以对VOCs 的研究也越来越多。同时，随着科技发展，检测VOCs 的方法也越来越精细，VOCs 研究要点在于样品前处理和VOCs 检测。样品前处理主要有溶剂萃取法、吹扫捕集法、静态顶空法和固相微萃取法。

溶剂萃取法是传统的提取工艺，主要利用样品中不同组分在不同溶剂中溶解度的差异对样品进行富集，从而实现分离、纯化。花青素、茶多酚等中药成分、大多数精油的提取等均用溶剂萃取法[23-24]，VOCs 测定使用较少。吹扫捕集法主要利用惰性气体将VOCs 连续吹出，然后通过吸附剂将其捕集，最后解析予以释放。吹扫捕集法适用于萃取沸点低于200℃，溶解度小于2%的VOCs，在水环境VOCs 的监测中广泛应用。静态顶空法主要将样品封闭于容器内，通过升高温度使VOCs逸出，并取得样品用于气相分析。静态顶空法适用于疏水性、沸点低的化合物。固相微萃取主要是利用涂有吸附剂的石英纤维萃取头吸附待测物利用样品与萃取相的饱和来实现微萃取。目前测定VOCs 使用较多的是吹扫捕集法和静态顶空法。另外，通过多种技术相结合可以提高VOCs 的回收率，如顶空固相微萃取。Lo 等[25]采用顶空固相微萃取和新型多维气相色谱-质谱-嗅觉测定法（MDGC-MS-O）系统同时识别从猪粪中排放的VOCs 和相关气味，共鉴定出295 种分子量为34～260的化合物，其中71 种化合物是具有臭味的化合物，提示顶空固相微萃取等VOCs 提取方法与现代高通量检测技术的联合应用，将成为深入研究粪污中VOCs 组成和功能的重要方法。

VOCs 的测定方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱法、膜导入色谱法、光声光谱法等，较为常用的是气相色谱法、气相色谱-质谱联用。

气相色谱法适用于分离易挥发而不易分解的物质。流动相是载气，通常用惰性气体氦气或者用氮气代替。固定相则有一薄层液体或者聚合物附着在一层惰性的固体表面构成。固定相装在由玻璃或金属制成的一根空心柱子内，称为色谱柱。载气带着样品通过色谱柱，样品各个组分在流动相和固定相之间多次分配调平，由于各个组分的结构和理化性质不同，在色谱柱中流动的速度也不一样，这样各个组分就会按照不同时间顺序从色谱柱中出来，然后先后进入检测器而被检测到。气相色谱-质谱联用集色谱高效分离与质谱特异性鉴定于一身。气相色谱-质谱联用可用于分离复杂的混合体系，同时对各组分定量定性，也能检测出尚未分离的色谱峰，灵敏度高。采用固相微萃取以及气相色谱-质谱联用测定畜禽粪便的VOCs，鉴定出了牛粪的44 种、猪粪的40 种、鸡粪的41 种物质[26]；采用吹扫捕集法以及气相色谱法分析猪粪好氧发酵产生的VOCs，并确定了猪粪中主要的致臭因子[27]。还有研究通过猪场粪肥现场试验，用气相色谱质谱联用仪分析粪肥发酵产生了81 种VOCs，并且主要在堆肥的前2 周逸出[28]。

3 畜禽粪便VOCs 在动物健康诊断中的应用价值

随着代谢组学技术的快速发展，粪中VOCs 在疾病检测方面的应用得到了长足发展。目前，大部分基于粪便VOCs 的健康诊断技术在人类医学上开展。研究发现，利用患者粪便中的VOCs 来替代其肠道环境，可区分炎症性肠病（IBD）和肠易激综合征（IBS）患者[29]；另外一些研究通过对比健康和肠道性疾病患者的粪便VOCs，发现80% 的受试者共同拥有44 种VOCs，而且与健康组相比，溃疡性结肠炎患者粪便中的挥发性模式有显著差异，提示从粪便中提取的挥发性有机化合物具有诊断胃肠道疾病的潜力[30]；同时，肥胖非酒精性脂肪肝患者与健康的人的粪便VOCs 存在显著差异，其中肥胖非酒精性脂肪肝组患者的粪便中酯类VOCs 显著高于健康人群[31]，提示粪便中酯类VOCs 含量可作为非酒精性脂肪肝的重要生物标记。黑色素瘤是一种最恶性的皮肤癌。有研究者鉴定并比较了皮下注射B16 黑色素瘤细胞前后小鼠尿液和粪便中VOCs 组成，发现注射B16 黑色素瘤细胞的小鼠尿液和粪便中分别有16 种和13 种VOCs 浓度显著提高，提示这些VOCs 可作为黑色素瘤细胞的潜在生物标志物[32]。在最近的一项研究中，93 位IBS 患者被随机分为低FODMAP（低果糖、半乳糖、低寡糖、乳糖、果糖和多元醇）饮食组和对照组，发现粪便VOCs 分析可以预测IBS 患者对低FODMAP饮食的反应[33]，提示粪便VOCs 是指征机体代谢的重要生物标志物。研究发现，机体糖代谢水平不仅与血液酮体、乙醇、甲醇有关，也与粪中VOCs 浓度有关，这也为基于粪便VOCs 水平评估人体糖原代谢状况提供了依据[34]。为了解婴儿胃肠道的发育和微生物定植，Costello 等[35]研究表明，与无症状成年人粪便中311 种VOCs 相比，早产儿粪中VOCs 仅检测出136 种，其中含氮化合物和含硫化合物的种类和浓度显著降低，提示早产儿发育与肠道菌群的功能单一性有关。另外，在坏死性小肠结肠炎（Necrotising Enterocolitis，NEC）的研究中，发现NEC 患儿体内酯类VOCs（特别是2-乙基己基乙酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯和十六酸乙酯这4 种特异性酯类）含量低于健康婴儿，提示VOCs 可能在NEC 的早期识别中起作用[36]。这些研究提示，基于粪便VOCs 组成和浓度判断哺乳动物机体的应激状况和代谢特征，是一项极具潜力的无损检测技术。

目前，在大型家畜（猪、牛等）的疾病诊断和营养代谢研究和实践中，存在样品采集不便和成本较高的问题，亟需发展家畜健康状况和代谢特征的无损采样和检测技术。但作为一项重要的无损检测技术，基于粪便VOCs 的健康-代谢诊断技术在畜牧业中研究较少。鸟分枝杆菌副结核亚种（Mycobacterium avium ssp.Paratuberculosis，MAP）是反刍动物慢性肠道疾病的病原体，通过对42 只山羊（对照组16 只，接种MAP菌 26 只）的呼吸和粪便中VOCs 进行分析，发现感染MAP 菌的山羊，粪中VOCs 浓度显著上调，提示粪便中VOCs 可以对反刍动物的慢性肠道疾病作早期诊断[37]。牛结核病（Bovine Tuberculosis）是影响公共卫生安全和畜牧业发展的人畜共患病，病原菌为牛型结核分枝杆菌（Mycobacterium Bovis），接种疫苗是限制牛结核病传播的重要方式。研究发现，接种了牛结核病疫苗的犊牛和未接种疫苗的犊牛粪便中的VOCs 组成呈显著差异，提示粪便中的VOCs 在畜禽疫苗接种检测领域具有重要应用价值[38]。慢性消耗性疾病（Chronic Wasting Disease，CWD）是一种天然存在的具有感染性、致命性、传染性的颈状海绵状脑病，该疾病确诊需要用免疫组织化学（IHC）方法对内侧咽后淋巴结或脑中的感染性朊病毒进行检测，但对生物流体或粪便中存在的低浓度朊病毒进行IHC 检测，进而使CWD 获得确诊并不可靠。近期研究发现，感染CWD 的白尾鹿与未感染CWD 的白尾鹿的粪便中VOCs 存在显著差异，提示粪便VOCs在鉴定活体动物CWD 感染状况中具有重要应用价值[39]。这些研究结果提示，粪便VOCs 可作为动物健康状况和疾病监测的重要生物标志物。粪便VOCs 分析还被探索用于诊断牛呼吸道疾病[40]、布氏杆菌病[41]、酮症酸中毒[42]等。这些研究提示，通过将畜禽粪便VOCs 和机体代谢和健康状况进行关联研究并开发基于粪便VOCs 的机体代谢和健康状况评估体系，将为动物代谢-健康状况无损检测理论的建立和应用提供重要支撑。

4 小 结

随着VOCs 检测手段的精细化和系统化发展，基于哺乳动物VOCs 的分类检测和精准测定得到了长足发展，并进一步结合粪便采集等无损样品采集技术，使其在生物医药领域特别是健康诊断领域取得了较好的应用前景。基于粪便VOCs 检测的畜禽健康诊断技术的开发和应用，并将其与现有的畜牧科学技术进行集成，势必将进一步推动畜牧业的发展。