HBV相关性肝细胞癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数差异分析

杨可立　关玉娟　杨湛　肖艳华　李剑萍　张霞意　吴丹丹



·论著·

HBV相关性肝细胞癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数差异分析

杨可立关玉娟杨湛肖艳华李剑萍张霞意吴丹丹

510060,广州市第八人民医院肝二科

【摘要】目的分析慢性乙型肝炎相关性肝细胞癌(HCC)患者肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数差异。方法利用Taqman real-time PCR检测27例肝细胞癌患者肝癌切除术后石蜡包埋肝癌组织和癌旁组织PDCD1基因(PDCD1)拷贝数。结果肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数之间无显著差异(P>0.05)；肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数与术前AFP水平无显著相关性(P>0.05)；肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数与肿瘤组织恶性程度无显著相关性(P>0.05)。结论PD1在肿瘤免疫逃逸反应中起作用，但肝癌组织及癌旁组织中其基因PDCD1的拷贝数变异并不是影响慢性乙型肝炎相关性肝细胞癌发生发展的因素。

【主题词】PD-1；PDCD1；肝细胞癌；基因;变异

Fund program: Guangzhou Medical and Health Science and Technology Project(20131A011072)

程序化死亡分子 (programmed death gene1，PD-1) 是B7/CD28 免疫球蛋白超基因家族重要成员，已被证实通过抑制T 细胞的活化和增殖来负调控免疫应答，并在调节免疫耐受、微生物感染及肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1 具有 PD-L1 及 PD-L2 两个受体，均属于 B7 家族成员，并参与肿瘤逃逸过程。研究发现 PD-L1 可通 过 PD-1依赖和非依赖机制促进肿瘤特异性T 细胞的凋亡，通过 PD-1 依赖机制抑制T细胞增殖并促进患者体内肿瘤细胞发生免疫逃逸反应[1]。在肝癌的研究中，国内贺兰湘等[2]的研究发现，在肿瘤局部表达可溶性受体 sPD-1 分子能阻断 PD-1/PD-L1 通路，可拮抗小鼠肝癌细胞 H22 通过 PD-L1 对 T 细胞的抑制作用，并显著抑制 H22 肿瘤生长。有研究表明慢性HBV感染者PD-1的基因PDCD1(programmed cell death 1)拷贝数及其mRNA表达在肝癌组、重肝组、携带组等不同临床表现的人群中的分布存在差异, PD-1基因多拷贝可能是HBV感染者发生肝癌的高危因素[3-4]。因此，本研究针对肝癌组织及癌旁组织PDCD1的基因拷贝数进行研究，分析肝癌肿瘤组织与癌旁组织PDCD1的基因拷贝数是否存在差异。

1对象与方法

1.1病例选择研究对象来自2013年12月至2015年3月在广州市第八人民医院肝癌切除患者的石蜡包埋病理标本，病理诊断均为肝细胞癌，共32例，其中女性5例、男性26例，平均年龄49.4±9.6岁，全部病例HBsAg(+)，排除HIV、HCV感染，排除酒精相关性肝病及自身免疫性肝病。入院病例均未曾接受介入、射频、化疗、靶向治疗等其他肝癌治疗。

1.2试剂和仪器PDCDl基因Taqman拷贝数检测试剂盒，内参RNase P基因拷贝数检测试剂盒，上述试剂盒均购自美国应用生物系统公司。QiagenDNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司。Applied biosystem 7500为美国 Applied biosystem公司产品。NanoDrop 2000为美国Thermo Scientific公司产品。

1.3方法

1.3.1肝癌组织及癌旁组织DNA提取:HBsAg阳性的肝细胞癌患者手术切除肝癌及癌旁组织均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、HE染色。取10 μm厚切片8～10张，对照HE切片分别选取肝癌组织和癌旁组织，尽量避开肿瘤坏死、出血区域等。使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 进口检测试剂盒提取组织基因组DNA。使用NanoDrop 2000确定DNA浓度，将提取的DNA稀释至20～50 mg/L。

1.3.2使用Taqman real-time PCR测定基因拷贝数:按照Taqman copy number assay RT-PCR配制反应体系，体系包括：2×TaqMan® Genotyping Master Mix 10 μl，20×TaqMan® Copy Number Assay(PDCD1基因引物)1 μl，20×TaqMan® Copy Number Reference Assay (RNase P) 1 μl，Nuclease-free water 4 μl，gDNA (5 ng/ μl) 4 μl，总反应体系20 μl。反应程序如下：95 ℃10 min后进行PCR循环，循环条件：95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，共40循环。使用Applied biosystem 7500 PCR仪进行以上反应，每个样本重复3次。以RNase P为内参，计算目的基因的相对拷贝数。将实验所得Ct值导出，并导入copycaller软件进行分析，得到样本的目的基因相对拷贝数。

1.4统计学方法采用SPSS17.0软件进行统计学分析。用独立样本的t检验比较肝癌组织与癌旁组织PDCD1基因拷贝数差异，以及分析不同拷贝数病例的AFP水平差异和肿瘤组织恶性度差异。并采用spearman进行肝癌组织和癌旁组织PDCD1基因拷贝数与术前AFP、肿瘤恶性程度相关性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.132例肝癌组织及癌旁组织PDCD1拷贝数检测5例由于扩增失败未能检测成功。在27例肝癌组织中PDCD1基因拷贝数为1的占11.1%，拷贝数为2的占66.7%，拷贝数为3的占14.8%，拷贝数为4的占3.7%，拷贝数>4的占3.7%；癌旁组织中1个拷贝数的0例，2个拷贝数的占59.3%，3个拷贝数占33.3%，4个拷贝数占7.4%，>4个拷贝数的0例(表1)，但两组间PDCD1基因拷贝数差异无统计学意义(t=-0.531，P>0.05)。

表1　肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数

2.2对肝癌组织PDCD1基因拷贝数与术前AFP水平进行spearman相关性分析得出相关系数为-0.08，P为0.691，无显著相关性；拷贝数为2的病例与其他拷贝数病例的AFP水平差异无统计学意义(t=-0.451,P>0.05)。癌旁组织PDCD1基因拷贝数与术前AFP相关系数为0.169，P为0.399，无显著相关性；拷贝数为2的病例与其他拷贝数病例的AFP水平亦差异无统计学意义(t=-0.271,P>0.05)。

2.3肝癌组织PDCD1基因拷贝数与肝癌组织肿瘤分化程度二者相关系数-0.262(表2)，P为0.187，无显著相关性；拷贝数为2的病例与其他拷贝数病例的肝癌组织病理恶性度分级差异无统计学意义(t=-0.293,P>0.05)。癌旁组织PDCD1基因拷贝数与肝癌组织病理恶性程度(见表1)相关系数为-0.149，P为0.457，无显著相关性；拷贝数为2的病例与其他拷贝数病例的肝癌组织病理恶性度分级亦差异无统计学意义(t=0.524,P>0.05)。

表2　肝癌组织及癌旁组织PDCD1基因拷贝数分布与肿瘤分化程度

3讨论

在控制肿瘤细胞的生长、扩散和复发过程中，T细胞介导的免疫应答有着重要的作用。T细胞的活化需要双信号作用，第一信号来自抗原肽-MHC复合物与T细胞表面受体(TCR)结合。第二信号来自抗原呈递细胞(APC)上协同刺激分子与T细胞表面上相应受体的结合[5]。协同刺激分子影响T细胞发育、活化、增殖、起效、凋亡的各个阶段[6]。缺少协同刺激分子提供的第二信号，会导致T细胞不能充分活化，使效应T细胞被诱导呈无能状态或凋亡，进而使得肿瘤逃脱机体的免疫监控。

近年来发现的肿瘤免疫逃逸反应中，PD-1/PD-L1 通路可抑制肿瘤特异性T细胞的活化，下调T细胞的肿瘤免疫反应。已有研究发现PD-1/PD-L1 通路在肝细胞癌中也有T细胞抑制作用。PD-l的基因PDCD1位于人类基因组2q37.3，位于已发现的拷贝数变异(copy number variations,CNVs)区域。研究表明，CNVs可通过基因的数量效应及结构变化对基因的表达产生影响，从而影响疾病的易感性和进展[7-8]。研究PD-1的基因CNVs是从宿主的遗传背景探讨慢性HBV感染相关性HCC的发病原因的新的探索。目前研究发现肝癌患者PDCD1的基因拷贝数分布及其mRNA表达与慢乙肝组有差异。但本研究发现肝癌组织与癌旁组织的PDCD1基因拷贝数无显著差异，同时其拷贝数与AFP水平及肿瘤分化程度无显著相关性。进一步分析发现不同PDCD1的基因拷贝数病例间的AFP水平和肿瘤分化程度均无显著差异。表明PDCD1的基因的拷贝数在肝癌组织及癌旁组织中的变异并不影响肿瘤分化程度。

既往研究表明肝癌患者PDCD1的基因拷贝数分布与非肝癌患者有差异，推测PDCD1的基因拷贝数变异是影响肝癌发生的因素之一。而通过本研究发现其拷贝数变异与肿瘤的分化无明显相关，推测与HCC的预后相关性不大。同时PD-1的配体PD-L1在肝癌组织中的变化情况有待进一步研究。现已在进行抗PD-1抗体治疗HCC的临床研究，因此明确PD-1/PD-L1通路在个体中是否存在差异及其差异的原因更有利于完善该免疫治疗方案，同时也可以为筛查HCC好发人群提供新的标志物。

4参考文献

[1]Prosser ME，Brown CE，Shami AF，et al. Tumor PD-L1 co-stimulates primary human CD8(+) cytotoxic T cells modified to express a PD1:CD28 chimeric receptor[J]. Mol Immunol，2012，51(3-4)：263-272. doi：10.1016/j.molimm.2012.03. 023.

[2]贺兰湘，张桂梅，贺宇飞，等. sPD-1 封闭 PD-L 促进抗瘤免疫的机制研究[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2006，5(26)：463-467.doi：10.3760/j:issn:0254- 5101.2006.05.021.

[3]杨湛，吴令杰，范慧敏，等.慢性乙型肝炎病毒感染者程序性死亡因子1基因拷贝数和 mRNA的表达水平[J].中华肝脏病杂志，2011，19(9)：678-682.doi: 10.3760/cma.j.issn. 1007-3418.2011.09.011.

[4]范慧敏，吴令杰，胡凤玉，等.原发性肝癌患者PD-1基因拷贝数及其转录和蛋白表达水平的研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，2012，26(4)：282-284.doi：10. 3760/cma.j.issn. 1003-9279.2012.04.013.

[5]Saito T，Yokosuka T，Hashimoto-Tane A. Dynamic regulation of T cell activation and co-stimulation through TCR-microclusters[J]. FEBS Lett，2010，584(24)：4865-4871.doi：10.1016/j.febslet.2010.11.036.

[6]Sharpe AH. Mechanisms of costimulation[J]. Immunol Rev，2009，229(1)：5-11.doi：10.1111/ j.1600-065X.2009.00784.x.[7]Feuk L，Carson AR，Scherer SW. Structural variation in the human genome[J]. Nat Rev Genet，2006，7(2)：85-97.doi：10.1038/nrg1767.

[8]Fellermann K，Stange DE，Schaeffeler E，et al. A chromosome 8 gene-cluster polymorphism with low human beta-defensin 2 gene copy number predisposes to Crohn disease of the colon[J]. Am J Hum Genet，2006，79(3)：439-448. doi：10.1086/ 505915.

通信作者：杨可立，Email：conco@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.007

基金项目：广州市医药卫生科技项目(20131A011072)

(收稿日期：2016-04-18)

Analysis of PDCD1 gene copy number differences between hepatocellular carcinoma tissues and paracancerous tissues of patients with HBV-related HCC

YangKeli,GuanYujuan,YangZhan,XiaoYanhua,LiJianping,ZhangXiayi,WuDandan

Guangzhou8thPeople’sHospital,Guangzhou510060,ChinaCorrespondingauthor:YangKeli,Email：conco@163.com

【Abstract】ObjectiveTo analyze the differences in the PDCD1 gene copy number of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues in patients with hepatocellular carcinoma(HCC)after HBV infection. MethodsAnalysis PDCD1 gene copy number of 27 paraffin embedded specimens of hepatocellular carcinoma tissues and para carcinoma tissues of patients with hepatocellular carcinoma after resection by Taqman real-time PCR. ResultsThe gene copy number of PDCD1 of hepatocellular carcinoma tissue and paracancerous tissue had no significant difference (P>0.05); the gene copy number of PDCD1 and preoperative AFP levels of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues had no significant correlation (P>0.05).Gene copy number of PDCD1 of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues had no significant correlation with tissue tumor malignant degree (P>0.05). ConclusionsPD-1 plays a role in the escape response of tumor immunity, but the PDCD1 gene copy number variation of hepatocellular carcinoma and paracancerous tissues is not a factor in carcinogenesis and development of hepatocellular carcinoma.

【Key words】PD-1;PDCD1; Hepatocellular carcinoma;Gene;Variation