伊曲康唑对皮肤鳞状细胞癌A431细胞抑制作用的初步研究

黄桃源 何仁亮

作者单位：510091 广东 广州，南方医科大学皮肤病医院皮肤外科

近年来多项研究显示，伊曲康唑(itraconazole，ITZ)具有抗肿瘤血管及淋巴管生成的作用，对基底细胞癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌等均有抑制作用，特别是对基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)的抑制作用已得到证实［1］。明确ITZ对哪种恶性肿瘤具有抑制作用，对确定ITZ的抗肿瘤范围具有重要意义，然而文献显示，除皮肤基底细胞癌外，其对其他皮肤恶性肿瘤作用的研究均较少，如由角质形成细胞过度增殖所致的皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是否也受ITZ的影响却鲜有报道。为此，笔者于本研究中观察了ITZ对CSCC A431细胞的生物学效应，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

CSCC A431细胞：广州吉妮欧生物科技有限公司生产;DMEM高糖培养基、100 U/mL青链霉素混合液：上海抚生生物科技有限公司生产;10%胎牛血清、胰蛋白酶：Gibco公司生产;PI染色试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司生产;伊曲康唑分散片：康芝药业股份有限公司生产，国药准字H20080494。

将伊曲康唑分散片溶于灭菌注射用水中，配成浓度分别为2、5、10、15、20、25及30μg/mL的溶液。

1.2 细胞培养与分组

将A431细胞置于含10%胎牛血清与100 U/mL青链霉素混合液的DMEM培养基中，并置于37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的孵化箱中培养，每2 d更换1次培养基。取对数生长期细胞随机分为2、5、10、15、20、25及30μg/mL浓度组与对照组。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况

(1)将各组A431细胞以1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中，依据分组分别加入等体积2、5、10、15、20、25及30μg/mL浓度的ITZ溶液及DMEM培养基后，置于37℃、5%CO2浓度的孵化箱中培养，并分别于培养24、48、72 h后每孔加入5 mg/mL浓度的MTT溶液20μL，继续培养4 h后，去上清，加入二甲基亚砜液150μL/孔，微波震荡10 min，使结晶物充分溶解。(2)采用酶标仪测定各组A431细胞在570 nm波长时的吸光度(optical density，OD)值(每组6个复孔，重复3次，结果取平均值)，并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率＝(1-ITZ组OD值/对照组OD值) ×100%。

1.4 流式细胞仪检测不同浓度ITZ溶液对细胞周期的影响

将各组A431细胞依据分组分别加入等体积2、5、10、15、20、25及30μg/mL浓度的ITZ溶液及DMEM培养基，置于37℃、5%CO2浓度的孵化箱中培养48 h后，加入胰蛋白酶消化处理，并用4℃预冷PBS吹打成单细胞悬液后，离心弃上清，而后置于-20℃预冷的70%冷乙醇中4℃固定24 h;取1 mL细胞悬液，用PBS洗3次，而后将细胞重悬于1 mL PI染液(终浓度为50μg/mL)中37℃孵育30 min;最后用Mcycle分析软件进行细胞DNA倍体分析，计算DNA相对含量。每组6个复孔，重复3次，结果取平均值。

1.5 RT-PCR法检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达水平

将各组A431细胞依据分组分别加入等体积2、5、10、15、20、25及30μg/mL浓度的ITZ溶液及DMEM培养基，置于37℃、5%CO2浓度的孵化箱中培养48 h后提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA(目的基因VEGF上游引物为5＇-CATGAACTTTCTG CTGTCTTGG-3＇，下游引物为5＇-GGTCTGCATTCAC ATTTGTTGT-3＇，扩增片段为396 bp;内参β-actin上游引物为5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，下游引物为5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇，扩增片段为205 bp)，95℃预变性3 min，94℃变性330 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统扫描拍照，检测各电泳条带灰度值，计算VEGF mRNA相对含量。每组6个复孔，重复3次，结果取平均值。

1.6 Western blotting法检测VEGF蛋白表达水平

将各组A431细胞依据分组分别加入等体积2、5、10、15、20、25及30μg/mL浓度的ITZ溶液及DMEM培养基，置于37℃、5%CO2浓度的孵化箱中培养48 h后收集各组细胞，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度;取120μg上样进行电泳、转膜及封闭后，一抗4℃孵育(鼠抗人VEGF单克隆抗体浓度为1∶200，鼠抗人β-actin单克隆抗体浓度为1∶600)过夜，二抗孵育2 h，BCI/NBT显色液显色，凝胶成像系统扫描拍照，检测目标基因VEGF条带与相应内参β-actin条带灰度值，并将其比值作为VEGF蛋白表达水平的半定量指标。每组6个复孔，重复3次，结果取平均值。

1.7 统计学处理

采用SPSS20.0统计软件对所得数据进行统计学分析，其中计量资料以均数±标准差表示，组间多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，两组间比较采用t检验;均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ITZ对A431细胞增殖的影响

随着ITZ浓度的增加及作用时间的增长，ITZ对A431细胞的抑制作用逐渐增强。其中，培养24 h时，各组细胞生长抑制率对比，除对照组与2μg/mL组、10μg/mL组与15μg/mL组、10μg/mL组与20μg/mL组、15μg/mL组与20μg/mL组及25μg/mL组与30μg/mL组组间对比，P＞0.05，差异无统计学意义外，其余各组组间两两对比，P均＜0.05，差异具有统计学意义;培养48 h时，各组细胞生长抑制率对比，除5μg/mL组、10μg/mL组、15μg/mL组及20μg/mL组组间两两对比以及25μg/mL组与30μg/mL组组间对比，P＞0.05，差异无统计学意义外，其余各组组间两两对比，P均＜0.05，差异具有统计学意义;培养72 h时，各组细胞生长抑制率对比，除5μg/mL组与10μg/mL组、5μg/mL组与15μg/mL组组间对比以及10μg/mL组、15μg/mL组、20μg/mL组组间两两对比，20μg/mL组、25μg/mL组、30μg/mL组组间两两对比，P＞0.05，差异无统计学意义外，其余各组组间两两对比，P均＜0.05，差异具有统计学意义(表1)。

2.2 ITZ对A431细胞周期的影响

与对照组相比，经浓度分别为2、5、10、15、20、25及30μg/mL的ITZ处理后，A431细胞的G0/G1期均出现延长，且除15μg/mL组与对照组对比，P＞0.05，差异无统计学意义外，其余各组与对照组对比，P均＜0.05，差异具有统计学意义，而S期与G2/M期虽也发生不同程度的改变，但未见明显规律(表2)。可见，ITZ可能能够通过抑制A431细胞G0/G1期向S期转化而减少DNA的合成。

2.3 ITZ对A431细胞内VEGF mRNA表达水平的影响

经浓度分别为2、5、10、15、20、25及30μg/mL的ITZ处理后，VEGF mRNA的表达水平分别为6.09±2.73、2.28±0.27、0.37±0.01、3.48±0.17、2.66±0.16、4.58±0.79及2.30±0.74(图1)，与对照组的1.11±0.66相比，除ITZ浓度为10μg/mL时，VEGF mRNA的表达水平明显降低(t＇＝4.756，P＝0.000，P＜0.05)外，ITZ浓度为2、5、15、20、25及30μg/mL时，VEGF mRNA的表达水平均明显升高(t/t＇值分别为 7.523、 6.961、 14.750、 9.683、 14.300 及5.092，P值均为0.000，P均＜0.05)。

表1 各组A431细胞生长抑制率对比Table 1 Comparison of growth inhibition rates of A431 cells by ITZ in each group

表1 各组A431细胞生长抑制率对比Table 1 Comparison of growth inhibition rates of A431 cells by ITZ in each group

注：各时间点各组A431细胞生长抑制率组间对比，其中与对照组对比，a P＜0.05，差异具有统计学意义;与2μg/mL组对比，b P＜0.05，差异具有统计学意义;与5μg/mL组对比，c P＜0.05，差异具有统计学意义;与10μg/mL组对比，d P＜0.05，差异具有统计学意义;与15μg/mL组对比，e P＜0.05，差异具有统计学意义;与20μg/mL组对比，f P＜0.05，差异具有统计学意义Note：Cell growth inhibition rates of A431 cells among different groups at each time point were compared：comparison with the control group(a P＜0.05)showed statistically significant difference;comparison with the2μg/mL group(b P＜0.05)showed statistically significant difference;comparison with the 5μg/mL group(c P＜0.05)showed statistically significant difference;compared with the10μg/mL group(d P＜0.05)showed statistically significant difference;comparison with the 15μg/mL group(e P＜0.05)showed statistically significant difference;comparison with the 20μg/mL group(f P＜0.05)showed statistically significant difference

组别Group标本数Number of samples 24 h 48 h 72 h对照组Control group 18 0 0 0 2μg/mL组2μg/mL group 18 -0.23±0.53 14.72±1.97a 61.09±5.03a 5μg/mL组5μg/mL group 18 2.71±0.74ab 29.71±3.97ab 71.27±3.66ab 10μg/mL组10μg/mL group 18 5.85±1.23abc 33.46±4.88ab 76.31±4.13ab 15μg/mL组15μg/mL group 18 5.73±1.00abc 33.97±0.99ab 77.75±5.01ab 20μg/mL组20μg/mL group 18 5.43±0.93abc 35.13±4.40ab 82.76±5.22abc 25μg/mL组25μg/mL group 18 7.69±0.68abcdef 44.28±4.61abcdef 86.86±2.59abcde 30μg/mL组30μg/mL group 18 8.68±0.43abcdef 49.03±3.65abcdef 85.82±1.10abcde F值F value 54.868 61.121 169.540 P值P value 0.000 0.000 0.000

表2 各组A431细胞周期对比Table 2 Effect of ITZ on cell cycle of A431 cells in each group

表2 各组A431细胞周期对比Table 2 Effect of ITZ on cell cycle of A431 cells in each group

注：t/t＇值与P值均为与对照组对比的统计值Note：t/t＇value and P value are both statistical values of comparison between the concentration groups and the control group

组别Group细胞数Number of cells G0/G1期G0/G1 phase细胞比率Cell ratio t/t＇值t/t＇value P值P value S期Sphase细胞比率Cell ratio t/t＇值t/t＇value P值P value G2/M期G2/M phase细胞比率Cell ratio t/t＇值t/t＇value P值P value对照组Control group 18 79.16±1.93 - - 9.06±1.03 - - 11.25±0.68 - -2μg/mL组2μg/mL group 18 84.92±1.00 11.240 0.000 2.51±0.66 22.720 0.000 10.53±2.35 1.249 0.220 5μg/mL组5μg/mL group 18 85.03±1.64 9.833 0.000 10.75±1.37 4.183 0.001 0.73±0.56 50.670 0.000 10μg/mL组10μg/mL group 18 87.34±0.42 17.570 0.000 7.20±0.51 6.866 0.000 0.29±0.32 61.870 0.000 15μg/mL组15μg/mL group 18 80.94±8.19 0.898 0.376 11.25±1.75 4.576 0.000 0.22±0.19 66.280 0.000 20μg/mL组20μg/mL group 18 83.76±1.13 8.726 0.000 10.76±0.75 5.661 0.000 0.79±0.74 44.160 0.000 25μg/mL组25μg/mL group 18 89.33±1.81 16.310 0.000 8.22±1.77 1.740 0.091 0.75±0.41 56.100 0.000 30μg/mL组30μg/mL group 18 90.56±0.79 23.190 0.000 2.67±1.84 12.860 0.000 6.00±2.50 8.597 0.000

图1 不同浓度ITZ处理的A431细胞内VEGF mRNA的表达量Fig.1 The expression level of VEGF mRNA in A431 cells treated with ITZ at different concentrations

2.4 ITZ对A431细胞内VEGF蛋白表达水平的影响

经浓度分别为2、5、10、15、20、25及30μg/mL的ITZ处理后，VEGF蛋白的表达水平分别为0.74±0.04、0.63±0.06、0.02±0.06、0.67±0.02、0.69±0.05、0.76±0.03、0.66±0.02(图2)，与对照组的0.11±0.05相比，除ITZ浓度为10μg/mL时，VEGF蛋白的表达水平明显降低(t＝4.889，P＝0.000，P＜0.05)外，ITZ浓度为2、5、15、20、25及30μg/mL时，VEGF蛋白的表达水平均明显升高(t/t＇值分别为41.740、28.250、44.120、34.800、47.290及43.330，P值均为0.000，P均＜0.05)。

图2 不同浓度ITZ处理的A431细胞内VEGF蛋白表达条带图Fig.2 Histogram of the expression of VEGF protein in A431 cells treated with ITZ at different concentrations

3 讨论

ITZ是在酮康唑结构基础上进行改造的三唑类广谱抗真菌药，具有口服吸收好、亲脂性强、抗真菌谱广以及副作用少等特点，在国内外皮肤科中被广泛应用于各类头癣、体癣、股癣、甲癣及手足癣等真菌感染性皮肤疾病的治疗。近年来研究发现，ITZ具有抑制皮肤恶性肿瘤细胞生长的作用［1］，如其对BCC的抑制作用在基础与临床研究中均已得到证实［2］。为明确ITZ对其他皮肤恶性肿瘤是否同样具有抑制作用，扩大其抗肿瘤的治疗范围，笔者于本研究中观察了ITZ对CSCCA431细胞的生物学效应。

相关研究发现，在体外BCC动物实验中，ITZ可通过特异性抑制Hedgehog信号转导通路中的SMO蛋白而下调该通路活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖［3-4］。本研究MTT检测结果显示，ITZ对A431细胞具有明显的抑制作用(P＜0.05)，且具有时间和药物浓度依赖性。鉴于已有研究表明，CSCC中Hedgehog信号转导通路处于激活状态［5］，我们猜测，ITZ可能通过降低Hedgehog信号转导通路活性而抑制A431细胞的增殖，值得深入研究探讨。另外，本研究还发现，经浓度为2、5、10、20、25及30μg/mL ITZ处理后的A431细胞，其G0/G1期均明显延长。可见，ITZ可能是通过抑制A431细胞G0/G1期向S期的转化来减少DNA的合成，从而抑制A431细胞增殖的。此外，VEGF被认为是促进肿瘤血管生成的重要生长因子，其可直接作用于血管内皮细胞，通过增加细胞通透性使不同纤维蛋白外渗，为各种纤维细胞、内皮细胞提供移动营养，诱导肿瘤血管的生成。而ITZ可通过破坏内皮细胞转移酶而影响内皮细胞代谢，将血管内皮细胞的增殖阻滞在G1期，从而抑制肿瘤血管的形成，进而影响VEGF等与血管生成有关的细胞因子的生成［6-8］。例如，有研究发现，ITZ联合索拉非尼抑制人脐静脉内皮细胞迁移和管腔形成及将细胞周期阻滞在G0/G1期的作用明显优于单独应用索拉非尼［9-10］;ITZ可通过抑制血管生成而达到治疗婴儿血管瘤的作用［11］。然而，本研究发现，ITZ对A431细胞内VEGF mRNA及蛋白表达的影响与过往文献不一致，只有在ITZ浓度为10μg/mL时可抑制VEGF的表达，其余浓度均使VEGF mRNA及蛋白的表达水平升高，ITZ对A431细胞内VEGF mRNA及蛋白表达水平的影响没有规律性，且经重复实验，结果与以上结果一致。由此推测，在ITZ抑制A431细胞增殖过程中可能存在其他抑制机制。

综上所述，ITZ能够抑制CSCC A431细胞的增殖并可延长细胞周期，然而，其对VEGF的影响却没有规律性，因此，其抑制细胞增殖的具体机制仍需进一步深入研究;部分研究显示的其通过抑制血管生成及降低Hedgehog通路活性而对抗肿瘤的作用机制，特别是在不同类型肿瘤间是否存在差异仍需深入探索。另外，由于ITZ胶囊中的微粒不溶于水，ITZ注射液为严格控制的抗生素类药物，因此，本实验中使用了ITZ分散片，但其剂型中含有崩解剂、表面活性剂和溶胀辅料等，可能对VEGF的实验结果有一定影响，有待后续实验验证。