蔗梢中多酚化合物的分离纯化及对冷鲜肉的保鲜作用

李思佳，孙卫东*，张业辉，刘磊, ，刘容

1. 广西大学轻工与食品工程学院（南宁 530004）；2. 广东农业科学院蚕业与农产品加工研究所（广州 510610）

我国甘蔗资源丰富，是产糖大国，年产量超过1亿 t。甘蔗除了含有丰富的蔗糖外，还含有大量对人类有益的植物甾醇、多糖、多酚、蔗脂、维生素和氨基酸等物质，其中多酚类化合物含量最高，多酚存在于植物体内，由羟基结构和苯环组成。植物多酚类物质因具有显著的抗氧化作用，能有效预防高血糖、高血脂、心脑血管等慢性疾病[1]，常被作为抑菌剂、防腐剂等应用于药品、营养保健等众多领域。因此国内外学者对多酚成分的分离鉴定及功能特性的研究比较感兴趣[2]。目前已经有研究将甘蔗中多酚以不同的方式提取出来，但是提取出来的甘蔗多酚粗提液中含有很多蛋白质、糖类等杂质，这些杂质会对多酚的进一步深入研究产生影响[3]。因此为了更好地研究甘蔗多酚的生物活性，对甘蔗多分酚粗提物进一步的分离纯化非常有必要。

聚酰胺分离纯化具有选择性强、试验操作简单、理化性质稳定、解吸条件温和、可再生等诸多优点，同时在多酚的分离纯化过程中有效成分不会失活，产品得率高，纯度好，特别适用于多酚的分离纯化[4]。因此，在完成多酚化合物提取的基础上，探讨了利用聚酰胺法对甘蔗多酚化合物分离纯化的工艺参数，为进一步研究甘蔗多酚类化合物的生物活性及功能特性的应用奠定基础[5]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

甘蔗，购于广西五里亭；冷切猪肉，市售；乙醇、甲醇、无水硫酸钠，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

柱层析聚酰胺（尼龙-6），浙江省台州市路桥四甲厂；UV-2802H型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HL-2衡流泵，上海沪西分析仪器有限公司；UV-1601紫外可见光分光光度计，日本岛津；电子分析天平，Metter-toledo Group；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Delta 320 pH计，梅特勒-托利多仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蔗梢多酚浓缩液的制备

准确称取一定量的甘蔗梢，按照料液比1∶4（g/mL），以60%无水乙醇为浸提溶在60 ℃条件下进行水浴提取2 h。旋转蒸发除去乙醇，得到甘蔗梢多酚浓缩液，于4 ℃冷藏保存，备用。

1.2.2 多酚含量的测定[6]

采用Folin-Denis法，测定总多酚含量。以单宁酸为标准，对照计算样品中多酚含量，标准曲线方程为y=0.043 6x+0.167，相关系数R2=0.998 7，其中y表示吸光度，x表示单宁酸含量（mg·L-1）。

1.2.3 聚酰胺树脂预处理

取一定量聚酰胺，用90%～95%乙醇进行浸泡，除去气泡，并装入柱中。用3～4倍体积的90%～95%乙醇溶液洗脱，直至洗脱液呈现透明并在蒸干后基本无残渣。再分别用2～2.5倍体积的5% NaOH溶液、1倍体积的蒸馏水、2～2.5倍体积的10%乙酸溶液，最后用蒸馏水洗至pH呈中性，备用[7]。

1.2.4 聚酰胺树脂筛选

准确称取3 g（约15 mL）经预处理的聚酰胺各置于锥形瓶中，加20 mL蔗梢多酚浓缩液，摇匀并过夜，过滤测其总多酚含量；40 mL 95%乙醇加入到聚酰胺中，浸泡10 h，测定总多酚含量。并按式（1）～（3）计算聚酰胺的吸附量、解吸率和吸附率。

式中：Q为总吸附量，mg；E为吸附量，%；D为解吸率，%；C0为起始溶液质量浓度，mg·mL-1；V0为起始溶液体积，mL；Ce为吸附平衡溶液质量浓度，mg·mL-1；Ve为吸附平衡溶液体积，mL；Cd为解吸溶液质量浓度，mg·mL-1；Vd为解吸溶液体积，mL。

1.2.5 静态吸附试验上样液pH的确定

室温下取3 g（3份）聚酰胺，置于3个100 mL三角瓶中，分别加水浸泡3 h，使其吸水饱和，滤掉多余水分，然后加入蔗梢多酚浓缩液20 mL，加入盐酸调节pH为2.0，4.0和6.0。按70次/min振荡吸附8 h，保温静置10 h，测其多酚含量。

1.2.6 动态吸附试验

1.2.6.1 上样流速的确定

取3 g（约15 mL）聚酰胺聚酰胺装入层析柱中，径高比1∶10，将3份质量浓度为4 mg·mL-1甘蔗多酚提取液以2，4和6 mL/min通过层析柱，测定多酚含量，绘制泄漏曲线[8]。聚酰胺的动态饱和吸附量按式（4）计算。

式中：C0为上样质量浓度，g·mL-1；V0为上样总体积，mL；Ci为流分i的质量浓度，g·mL-1；Vi为流分i的体积，mL。

1.2.6.2 洗脱剂用量的确定

取甘蔗梢多酚浓缩液稀释至4 mg·mL-1，调pH为4，以3 mL·min-1的流速通过预处理好的聚酰胺柱（50 mL）。先用纯化水洗至Molish反应为阴性后，再用无水乙醇进行洗脱，洗脱剂浓度为20%，40%，60%和80%，浓缩洗脱液并检验[9]。

1.2.7 蔗梢多酚保鲜作用的研究

配制5组抗氧化剂溶液，分别为A组（Skip+test，蒸馏水）、B组（STP，0.02%甘蔗梢多酚溶液）、C组（STP+VC，0.04% VC溶液+0.02%甘蔗梢多酚）、D组（STP+VE，0.04% VE溶液+0.02%甘蔗梢多酚）、E组（STP+VC+VE，0.04% VC+0.04% VE溶液+0.02%甘蔗梢多酚），加入到冷鲜肉中，置于温度为4±0.5 ℃冷藏。分别于0，1，3，5，7和9 d对肉样进行指标测定，每次取3个重复试验的平均值，考察各组抗氧化剂的保鲜效果[10]。

1.2.7.1 pH的测定

采用酸度计法GB/T 5009.45—2003，取10.00 g绞碎的冷鲜肉样品于烧杯中，加入20 mL蒸馏水，搅拌均匀，静置15 min，然后用pH计进行测定[11]。

1.2.7.2 过氧化值（POV）的测定[12]

POV按GB/T 5009.37—2003中滴定法进行测定。

1.2.8 数据处理

采用Origin软件作图和SPSS分析处理数据。

2 试验结果与分析

2.1 树脂筛选

由表1显示，80～100目聚酰胺的甘蔗多酚残留量比60～80目和100～200目聚酰胺低，吸附量、解吸量和解吸率明显比60～80目和100～200目聚酰胺高很多。由此可见，80～100目聚酰胺对多酚类化合物分离富集效果较好。

2.2 上样液pH的确定

由表2中可知，pH增大，吸附量先增加后减小。pH为4，吸附后残余多酚含量和吸附量最大，吸附量约为36.67 mg·g-1。

2.3 上样流速的确定

由表3可知，溶液流速增加，饱和吸附量减小，加快流速会导致吸附效率减小，不利于甘蔗梢多酚的分离纯化，造成原料损失。所以上样流速在2～4 mL·min-1最佳。

表3 不同流速下的泄漏参量

2.4 洗脱剂用量的确定

由图1可知，多酚的含量随着洗脱剂浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，当洗脱剂的浓度为60%时，多酚含量最多，为175.67 mg。

图1 不同洗脱液对甘蔗梢多酚的洗脱效果

2.5 蔗梢多酚保鲜作用的研究

2.5.1 pH测定

由图2可知，冷鲜肉的pH是先上升后下降的，因为动物被屠宰后的生理变化可分为僵硬、解僵和自溶[13]。前期糖元降解不断产生乳酸等酸性物质，使pH下降，随着贮藏时间的延长，冷鲜肉中的氨基酸、蛋白质等不断分解产生挥发性的胺类物质，导致pH上升。对照组的pH升高较快，第3天后的pH超过新鲜肉的标准，与其他各组之间差异显著[14-17]。其他各组第9天时仍未超过正常范围，说明复合化学保鲜剂和溶菌酶等能有效控制肉样的pH变化，增强肉的保鲜效果[18]。

2.5.2 过氧化值的测定

过氧化值（POV）是表征脂肪酸和油脂等被氧化程度大小的一种指标。图3表明，不同预处理条件下肉样中的过氧化物含量都是先上升再下降的趋势。在5 d左右，所有肉样的POV值全部升至最高值，然后下降[19]。在整个期间，1组（对照组）的POV值普遍高于其他各组；2组（甘蔗梢多酚）的POV值也较高，仅次于1组（对照组）；4组（甘蔗梢多酚+VE）的POV比3组（甘蔗梢多酚+VC）低；5组（甘蔗梢多酚+VC+VE）肉样的POV值一直保持最低[20]。因此，各组肉样的抗氧化效果依次为：5组＞4组＞3组＞2组＞1组。

图2 冷鲜肉保存期间pH的变化

图3 冷鲜肉保存期间POV值的变化

3 结论

聚酰胺吸附层析法对植物成分的纯化和分离主要用于生物碱、多糖、黄酮类、皂苷等成分的研究。它工艺操作简单，对多酚等活性物质分离纯化效果好，且再生重复使用，成本低，可以节约能源和耗材等一些辅助物品。因此被广泛地应用于各种功能成分的分离纯化，优化工艺条件如下：80～100目聚酰胺，溶液pH为4，上样流速在2～4 mL·min-1之间，60%乙醇溶液洗脱。纯度可达86.15%。与未加甘蔗多酚的样品的POV值和pH对比可知，甘蔗多酚对冷鲜肉有保鲜的效果，其中保鲜效果最好的组合是甘蔗梢多酚+VC+VE，与其他几种处理方法相比POV值处于较低水平，且pH变化非常稳定。