HPLC 法测定红芽姜中3 种姜辣素类化合物的含量*

★ 张华 严国鸿 赖昕 刘永静 徐伟 褚克丹* 孙承韬

（1.福建中医药大学药学院 福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院 福州 350000）

红芽姜，又称青州竹根姜，生长分布于我国山东、福建、湖南，在福建省内主要种植于闽北、三明、漳州等地。其植株生长势强，分枝数多。根茎皮淡黄色，芽淡红色，根茎肉色蜡黄，纤维少。单株根茎重可达500g 左右，其中含有丰富的姜辣素，是传统中药炮制的优质原料药材［1］，生姜汁入药始见于汉代张仲景《金匮玉函经》是生姜捣绞取汁［2］。其作为炮制辅料始见于南北朝《刘涓子鬼遗方》 ，其历代文献中姜制饮片多达90 多种，姜制方法有生姜浸、生姜自然汁拌蒸、姜汁浸焙、姜汁炙（炒）、姜汁煮、姜汁浸、姜汁煨、生姜汁淬等。沿用至今多为姜汁炒、姜汁煮［3］。姜辣素是姜酚、姜醇、姜酮等生姜中辣味成分的总称，具有抑制血小板聚集、抗氧化、改善心血管和胃肠道功能、增强免疫力等作用，其中以6-姜酚含量最高［4］。《中国药典》2015 年版将以6-姜酚（C17H26O4）、8-姜酚（C19H30O4）和10-姜酚（C21H34O4）为代表的姜辣素类化合物作为生姜含量测定项下的指标性成分［5］，并规定6-姜酚的含量不得低于0.05%，8-姜酚和10-姜酚总量不得低于0.04%。

目前，对于福建闽产红芽姜的品质评价研究尚未系统展开，本研究采用HPLC 法同时测定了福建省不同产地红芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚这3 中姜辣素类化合物的含量，为建立以红芽姜主要成分为基础的质量标准提供科学依据，为保证以红芽姜为炮制辅料的红芽姜制半夏药材品质，为闽产红芽姜的进一步推广应用奠定理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器高效液相色谱仪（美国Thermo Sctentific公司，型号：UltiMate3000 型）；电子天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司，型号：XS105Du）；超纯水机（密理博中国有限公司，型号：Milli-Q Advantage）；数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE）。

1.2 试药6- 姜酚标准品（批号：150623，四川维克奇生物科技有限公司）；8-姜酚（批号：111993-201601，中国食品药品检定研究院）；10-姜酚标准品（批号：111994-201501，中国食品药品检定研究院）；红芽姜（不同产地批次药材由福建承天药业有限公司提供，经福建中医药大学药学院褚克丹教授鉴定为姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鲜根茎）；乙腈、甲醇为色谱纯（美国DIKMA 公司）；实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10min，A：25%→40%；10～25min，A：40%；25～40min，A：40%→80%；40～45min，A：80%→25%），检测波长为282nm，进样量为10μL，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。在上述色谱条件下，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚3 种成分色谱峰峰间分离度良好（各相邻色谱峰的分离度均大于1.5），理论板数按6-姜酚峰计算不低于5000，结果见图1。

图1 对照品（A）及样品（B）液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备分别精密称取6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚标准对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.74、0.63、0.88mg/mL 的对照品溶液，分别精密移取上述3 种对照品溶液4.0、1.0、1.0mL 置于25mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得含有6-姜酚118.4μg/mL、8-姜酚25.2μg/mL 和10-姜酚35.2μg/mL 的混合对照品溶液，均置于4℃保存备用。

2.3 供试品溶液的制备取红芽姜碎末5g，精密称重，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量后超声提取40min（300W，25kHz），冷却后称定重量，甲醇补足失重，摇匀后用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系的考察分别精密吸取“2.2 项下”混合对照品溶液2，5，10，15，20μL 进样分析，以进样的样品量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归得3 种成分的回归方程和相关系数，见表1。由表1 可知，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在相应范围内，进样量（μg）与峰面积呈良好的线性关系。

表1 3种姜辣素类成分标准曲线

2.5 精密度试验精密吸取“2.2” 项下混合对照品溶液连续进样6 次，分别记录3 种姜辣素类成分的峰面积，计算得6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面积的RSD 值分别为1.03%、1.37%、1.74%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验取同一批次红芽姜，照“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，记录峰面积，计算红芽姜中6-姜酚的含量平均值为1.16mg/g、8-姜酚的含量平均值为0.25mg/g、10-姜酚峰的含量平均值为0.38mg/g，RSD 值分别为1.88%、1.39%、1.72%（n=6），表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验取同一批次红芽姜，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24、36、48h 进样，记录峰面积，计算6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚峰面积的RSD 值分别为1.50 %、1.69%、1.83%（n=8），表明处理后的供试品溶液在48h 内稳定。

2.8 加样回收率试验称取已知6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚含量的红芽姜样品3g，共6 份，分别精密移取质量浓度为0.74 mg/mL 的6-姜酚对照品溶液5mL，0.63mg/mL 的8- 姜酚对照品溶液1.2mL 和0.88mg/mL 的10- 姜酚对照品溶液1.2mL。照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定各成分峰面积，计算回收率。结果见表2，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的平均回收率分别为100.71%，98.46%和99.23%；RSD 值分别为1.65%，1.28%和0.82%（n=6）。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定分别称取不同产地各6 批次的红芽姜样品，照“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，计算红芽姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量。结果表明，不同产地红芽姜中姜辣素类成分含量均有一定差异，结果见表3。

表3 不同产地红芽姜中3种姜辣素类化合物的平均含量（n=6）

3 讨论

红芽姜化学成分复杂，其中，姜辣素是生姜及其炮制品中的主要有效成分，其中含量最高的是姜酚类化合物，主要包括6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚等10 余种成分，其中又以6-姜酚居多［6］。姜酚类化合物具有较高的生物活性和广泛的药理作用，可以作为评价红芽姜药物品质的重要指标，本研究前期采用单因素考察法，分别考察了提取溶剂（水、甲醇、乙醇、正丁醇），提取方法（加热回流提取和超声提取）以及提取时间，利用HPLC 法进样分析，最终采用超声提取（超声功率和频率为：300W，25kHz），提取时间为40min，提取溶剂为甲醇的提取工艺。

色谱条件方面，紫外全波长扫描结果显示：6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚在282 nm 附近具有最大吸收，因此本实验选择282 nm 作为测定波长。同时，流动相体系方面，实验比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液和中国药典2015 年版中生姜含量测定项下的乙腈-0.1%醋酸水溶液，最终结果表明，与使用乙腈-0.1%醋酸水溶液相比，乙腈-0.1%磷酸水溶液对三种姜酚类成分的分离度较高，且峰型较好、保留时间适宜，测定时间较药典方法缩短了13min（药典梯度洗脱时间为58min）。

本研究建立的HPLC 法所测得的3 种姜酚类化合物含量准确，且重现性好、专属性强，说明该方法成熟可靠，测得结果表明，红芽姜中3 种姜酚类化合物含量均满足《中国药典》对生姜项下含量测定的要求，其中6-姜酚含量远高于药典标准，保证了以红芽姜为炮制辅料的红芽姜制半夏的药材品质，有利于红芽姜在中药市场上的推广。同时，也为红芽姜的品质评价研究提供了有效依据，为下一步质量标准的建立奠定了理论基础。

本实验通过考察闽产红芽姜中3 种姜辣素类化合物的含量，对福建省内不同产地的红芽姜进行测定。经测定：福建建阳所产红芽姜中的6-姜酚和8-姜酚含量最高，其中8-姜酚含量为为福建南靖所产红芽姜的1.19 倍。福建光泽所产红芽姜中的10-姜酚含量最高，为福建南靖所产红芽姜的1.13 倍。综上，3 种姜辣素类化合物中，产地差异最明显的为8-姜酚，对比同类型文献［7］，其姜辣素类成分（6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚）含量较河南、山东等地所产生姜高。