RNA甲基转移酶BCDIN3D的表达与乳腺癌预后的关系

包昶宇, 钟勇

乳腺癌的病因复杂，其临床特点和分子病理特征呈现高度多样化[1]。乳腺癌具有高度异质性,其基因分型包括Luminal A、Luminal B、ERBB2+、Basal-like等多种表型[2]。RNA修饰是一种基因表达的表观遗传调控,类似于DNA甲基化和组蛋白修饰。BCDIN3D是靶向核酸的5′单磷酸的甲基转移酶,属于Bin3甲基转移酶家族的成员[3]。既往研究发现RNA甲基转移酶BCDIN3D阳性表达患者的无病生存率较阴性表达者降低[4]。目前国内有关RNA甲基转移酶BCDIN3D表达与乳腺癌预后的研究报道尚少见。本研究旨在探讨RNA甲基转移酶BCDIN3D的表达与乳腺癌患者预后的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2013年6月至2015年1月我院收治的乳腺癌患者。纳入标准:手术前均行空心针穿刺组织病理学检查,明确诊断为乳腺浸润性导管癌;Ⅰ期至Ⅲa期[TNM分期参考2003版国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)标准]；符合手术适应证；无肿瘤病史；初次确诊为乳腺癌，入院前无其他乳腺癌相关治疗;无远处转移灶。排除标准:特殊类型乳腺癌,如炎性乳腺癌、导管内癌、鳞癌等;正在参与其他研究者;纳入研究对象间存在血缘关系者;不能耐受化疗者;治疗中途退出者;严重肝肾功能不全者;合并其他系统肿瘤者。按上述标准最终纳入研究对象80例,年龄19～65岁,平均(46.7±4.7)岁;基因分型Luminal A、Luminal B、ERBB2+、Basal-like型分别有10、32、20、18例;肿瘤分期T0～1、T2、T3分别有9、34、37例;淋巴结分期N0～1、N2、N3分别有9、38、33例;人表皮生长因子受体2(Her-2)阳性25例。

1.2 治疗方法 患者入院后均行标准乳腺癌改良根治术,术后接受蒽环联合紫衫方案(EC-T,6～8周期)化疗。25例Her-2阳性患者中15例接受曲妥珠单抗(赫赛汀)靶向治疗(8 mg/kg初始负荷量,随后每3周6 mg/kg维持量,静脉输注,疗程52周)。74例腋窝淋巴结阳性患者接受放疗(同侧胸壁及锁骨上区放疗,剂量40～60 Gy)。42例雌激素受体(ER)或孕激素受体(PR)阳性患者接受内分泌治疗(他莫西芬20 mg/d,口服)。

1.3 免疫组织化学法检测BCDIN3D的表达 将术中获得的乳腺癌组织标本使用福尔马林固定,石蜡包埋,经脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤制备4 μm连续组织切片,采用免疫组织化学法(IHC,免疫组化试剂盒购自美国Zymed公司)检测BCDIN3D的表达。具体步骤:石蜡切片烘片2 h,使用pH 7.4 PBS冲洗3次,将石蜡切片浸入pH 6.0的0.01 mol/L柠檬酸钠盐缓冲液进行抗原修复,在121 ℃下煮沸5 min,然后慢煮2 min。加入3%过氧化氢阻断剂,孵育20 min以淬灭内源性过氧化物酶活性,除去PBS液,加入一抗小鼠抗人BCDIN3D抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司,稀释比例1∶200),通过辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG交叉吸附二抗(赛默飞生物科技有限公司)检测一抗,然后用3,3-二氨基联苯胺(DAB,武汉博士德生物工程有限公司)进行比色检测,苏木精复染。将制备好的切片置于显微镜下(×200倍)观察。

检测结果由我院工作5年以上病理科主任医师进行判读。阳性染色定位于细胞质,染色强度:0,无染色;1,微弱/可疑;2,中度;3,强。着色细胞百分比:0,无染色;1,<10%染色的细胞;2,10%～50%的细胞;3,>50%的细胞染色。根据染色强度以及着色细胞百分比评分的乘积进行评定,<3分为阴性,≥3分为阳性。

1.4 随访方法 在患者首次入院后,即开始随访,治疗后前3年每3个月随访1次,其后每6个月随访1次,随访方式包括门诊、电话等。随访截止日期为2018年10月30日。总生存期(OS)指随访期间出现死亡或随访截止时间距离初次随访时间的间隔。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计数资料以例(%)表示,组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并用Log-rank检验比较生存差异。采用单因素、多因素COX比例风险模型分析乳腺癌患者预后的影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCDIN3D表达与乳腺癌患者临床病理特征 80例乳腺癌患者中,BCDIN3D阳性表达者30例(37.5%);BCDIN3D阴性表达者50例(62.5%),见图1、2。BCDIN3D阳性表达者与BCDIN3D阴性表达者间肿瘤分期和淋巴结分期差异有统计学意义(P<0.05),其中BCDIN3D阳性表达者以T2、N2期为主;BCDIN3D阳性表达者与BCDIN3D阴性表达者间不同年龄、月经状态、分子分型差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

图1 乳腺癌组织中BCDIN3D的表达(HE×200)

图2 乳腺癌组织中BCDIN3D阴性表达(HE×200)

2.2 BCDIN3D表达与乳腺癌患者OS 本组有74例患者获得随访，6例失访，中位随访时间为42(23～64)个月，随访中有20例(25.0%)死亡，中位OS为45.6(23～59)个月。Kaplan-Meier分析结果显示，BCDIN3D阳性表达者、BCDIN3D阴性表达者的中位OS分别为41.2(95%CI：31.2～46.9)、49.5(95%CI：42.1～51.6)个月，BCDIN3D阳性表达者的OS短于BCDIN3D阴性表达者(χ2=25.241，P<0.001)，见图3。

图3 不同BCDIN3D表达乳腺癌患者的OS

2.3 COX比例风险模型分析乳腺癌患者预后的影响因素 单因素分析结果显示，与乳腺癌患者预后可能有关的因素包括：肿瘤大小、淋巴结状态、分子分型、BCDIN3D表达、靶向治疗，见表2；多因素COX分析结果显示(表3)，肿瘤分期、淋巴结分期、分子分型、BCDIN3D表达是影响乳腺癌患者OS的独立预后因素(P<0.05)。

表1 BCDIN3D表达与乳腺癌患者临床病理特征比较[(%)]

表2 乳腺癌患者生存资料的单因素分析

表3 乳腺癌患者生存资料的的多因素分析

3 讨论

miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用是目前的研究热点之一[5-6]。miRNA可导致编码蛋白质的翻译减少和(或)mRNA本身的降解[7]。研究显示,miRNA广泛参与细胞发育、分化、增殖、凋亡、应激反应和病毒防御等过程,在肿瘤发生发展过程中发挥调控作用[8-9]。

miRNA形成的关键步骤涉及RNA分子的5′末端,该结构对miRNA的准确加工以及维持成熟RNA诱导沉默复合体(RISC)的稳定性十分重要[10]。BCDIN3D在体外和体内甲基化miR-145前体的5′末端单磷酸基团,导致其负电荷的完全丧失,人细胞中BCDIN3D的消耗导致较低水平的pre-miR-145和伴随的成熟miR-145的增加。

在本研究中,BCDIN3D阳性表达者入院时N2比例较BCDIN3D表达阴性者高,BCDIN3D表达阳性者入院时肿瘤负荷大于BCDIN3D表达阴性者,提示BCDIN3D表达可促进乳腺肿瘤淋巴浸润和肿瘤细胞浸润。Blazer等[11]研究显示,BCDIN3D可加工miRNAs,对多种关键生物学过程起重要作用,如影响miR-145的成熟、修饰miR-145前体、甲基化细胞质组氨酸转移RNA等,甚至可导致癌症的发生。有研究发现,BCDIN3D甲基化miRNA前体的5′末端单磷酸基团可增加肿瘤发生表型和细胞侵袭性[3]。

Yao等[4]研究显示早期乳腺癌患者中BCDIN3D的阳性表达率为49.6%,而本研究结果显示，BCDIN3D的阳性表达率为37.5%(30/80),较Yao等[4]研究结果低,其原因可能与入组病例数、个体差异、临床分期等差异有关。Yao等[4]研究发现,BCDIN3D阳性表达者的无复发生存率较BCDIN3D阴性表达者差。本研究结果显示,BCDIN3D阳性表达者的OS较BCDIN3D阴性表达者短;COX比例风险模型分析结果显示,BCDIN3D阳性表达是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。此外,肿瘤分期、淋巴结分期、分子分型也是影响乳腺癌患者OS的独立预后因素,这与龚晏萱等[11]的研究结果一致。

综上所述,BCDIN3D阳性表达是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。但本研究样本量较少,仅对患者OS这一项预后指标进行分析,且为单中心研究,研究结论尚需进一步验证。