白藜芦醇对卵巢癌细胞增殖活力、增殖基因mRNA表达及Wnt信号通路的影响

侯政瑶, 高杰, 吴雨, 孙晓宁, 杨小琛

卵巢癌是临床常见的女性生殖系统恶性肿瘤,发病率仅次于宫颈癌和宫体癌,死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤首位。卵巢癌的早期症状不典型,诊断难度大,多数患者确诊时已经为中晚期,通过细胞减灭手术及辅助化疗能够消灭或杀伤病灶,但在治疗过程中容易出现复发及转移,整体预后情况较差。白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生、决明、藜芦等多种植物中的多酚类化合物,具有抗炎、抗氧化、免疫调节等活性,被证实在心肌梗死、脑梗死动物模型中能够发挥保护作用[1-2]。近年来关于白藜芦醇生物学活性的基础研究发现,白藜芦醇在胃癌、乳腺癌、前列腺癌中能够发挥抗肿瘤作用[3-5]。为了明确白藜芦醇在卵巢癌治疗中的潜在价值,本实验用白藜芦醇干预卵巢癌细胞SKOV3,通过检测细胞增殖活力及增殖基因mRNA表达、Wnt信号通路中分子蛋白表达情况,以期探讨白藜芦醇对卵巢癌的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

卵巢癌SKOV3细胞株购自ATCC公司;细胞培养试剂,包括DMEM、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;胰蛋白酶、白藜芦醇购自Sigma公司;细胞活力检测所用MTS试剂盒购自Promega公司;基因mRNA表达水平检测所用试剂盒购自北京天根公司,基因特异性引物购自上海生工公司;糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)及β-actin的第一抗体购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及药物干预 SKOV3细胞用含有5%FBS的DMEM培养,细胞生长至80%～90%后用0.125%胰酶进行消化传代,传代后的细胞接种在细胞板内并进行随机分组。对照组用不含药物的DMEM处理,白藜芦醇组用含有不同剂量(20、40、80 μmol/L)的白藜芦醇处理。

1.2.2 酶标仪检测卵巢癌细胞的增殖活力 消化后的细胞接种在96孔培养板内,不同条件处理24 h后,向培养孔内加入MTS试剂盒的检测液(20 μl/孔),将培养板在培养箱内继续孵育4 h后取出,放入酶标仪并测定490 nm波长处的光密度(OD)值,记为OD490,以此值反映卵巢癌细胞的增殖活力。

1.2.3 荧光定量PCR检测卵巢癌细胞中增殖基因的mRNA表达量 消化后的细胞接种在6孔培养板内,不同条件处理24 h后,采用RNA提取试剂盒提取细胞内的总RNA,采用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒将RNA反转录为cDNA,采用Talent荧光定量检测试剂盒及基因特异性引物对cDNA中的c-myc、细胞周期蛋白A(cyclin A)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)进行荧光定量PCR扩增,在PCR仪上生成反应循环曲线及相应的循环阈值,根据循环阈值计算基因的mRNA表达水平。

1.2.4 Western blotting检测卵巢癌细胞中β-catenin和GSK-3β的蛋白表达量 消化后的细胞接种在6孔培养板内,不同条件处理24 h后,采用蛋白裂解液分离提取细胞中的总蛋白,蛋白样本与上样缓冲液混合后高温变性,将变性后的蛋白样本加入聚丙烯酰胺-SDS分离凝胶内,电泳使不同分子量的蛋白质分离后电转移至NC膜,NC膜放入5%脱脂牛奶中封闭2 h,洗膜后孵育1∶1 000稀释的β-catenin、GSK-3β第一抗体及1∶5 000稀释的β-actin第一抗体,4 ℃过夜;第2天洗膜后室温孵育1∶2 000稀释的第二抗体2 h,加入ECL显影液并曝光得到β-catenin、GSK-3β及β-actin的蛋白条带,根据蛋白条带的灰度值计算蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞的增殖活力比较

20、40、80 μmol/L白藜芦醇组SKOV3细胞的OD490值均低于对照组,且随着白藜芦醇剂量的升高,SKOV3细胞的OD490值逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 对照组与白藜芦醇组细胞的OD490值比较

注:a与对照组比较,P<0.05;b与20 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05;c与40 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05

2.2 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞中细胞周期基因的mRNA表达水平比较

20、40、80 μmol/L白藜芦醇组SKOV3细胞中c-myc、cyclin A、cyclin D1的mRNA表达水平均低于对照组,p21 mRNA表达水平高于对照组,且随着白藜芦醇剂量的升高,c-myc、cyclin A、cyclin D1的mRNA表达水平逐渐下降,p21 mRNA表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞周期基因mRNA表达水平比较

注:a与对照组比较,P<0.05;b与20 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05;c与40 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05

2.3 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞中上皮间质转化(EMT)基因的mRNA表达水平比较

20、40、80 μmol/L白藜芦醇组SKOV3细胞中N-cadherin、Vimentin的mRNA表达水平均低于对照组,E-cadherin mRNA表达水平高于对照组,且随着白藜芦醇剂量的升高,N-cadherin、Vimentin的mRNA表达水平逐渐下降,E-cadherin mRNA表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞中EMT基因的mRNA表达水平比较

注:a与对照组比较,P<0.05;b与20 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05;c与40 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05

2.4 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3细胞中Wnt通路分子的表达水平比较

20、40、80 μmol/L白藜芦醇组SKOV3细胞中β-catenin的蛋白表达水平均低于对照组,GSK-3β的蛋白表达水平高于对照组,且随着白藜芦醇剂量的升高,β-catenin的蛋白表达水平逐渐下降,GSK-3β的蛋白表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表4,图1。

表4 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3中β-catenin和GSK-3β的蛋白表达水平比较

注:a与对照组比较,P<0.05;b与20 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05;c与40 μmol/L白藜芦醇组比较,P<0.05

图1 对照组与白藜芦醇组卵巢癌SKOV3中β-catenin、GSK-3β的蛋白表达条带

3 讨论

近年来,我国的卵巢癌发生率呈逐年升高趋势且早期诊断率较低,约70%的卵巢癌患者初次确诊时已经处于中晚期,部分患者甚至出现了腹腔种植转移。目前针对中晚期卵巢癌的主要治疗手段包括细胞减灭术及辅助化疗,均无法彻底清除病灶,治疗过程中的复发率较高[6]。白藜芦醇是新发现的具有抗癌活性的多酚类化合物,广泛存在于葡萄、花生、决明等植物中,来源广泛[7-8]。本实验结果显示不同剂量的白藜芦醇干预卵巢癌细胞24 h后,卵巢癌细胞的增殖活力(OD490值)均明显下降,且白藜芦醇剂量越高,OD490值越低,提示白藜芦醇能够以剂量依赖性的方式抑制离体培养的卵巢癌细胞的增殖,具有显著的抗卵巢癌作用。

在明确白藜芦醇能够抑制卵巢癌细胞增殖后,本实验进一步分析了增殖及EMT相关基因的改变。不同剂量的白藜芦醇干预卵巢癌细胞24 h后,c-myc、cyclin A、cyclin D1、N-cadherin、Vimentin的mRNA表达均明显减少,p21、E-cadherin的mRNA表达均明显增多,且白藜芦醇剂量越高,上述基因mRNA表达的变化越明显。c-myc、cyclin A、cyclin D1是细胞周期的正性调控分子,能够促进细胞周期不同阶段的相互转化,加速细胞周期发生,卵巢癌中c-myc、cyclin A、cyclin D1呈明显高表达的趋势[9-11];p21是细胞周期的负性调控分子,能够拮抗cyclin A、cyclin D1加速细胞周期的生物学活性、使细胞周期停滞,卵巢癌中p21呈明显低表达的趋势[12]。E-cadherin是EMT过程中上皮表型的标志基因,N-cadherin、Vimentin是EMT过程中间质表型的标志基因,过度的EMT会使细胞增殖活性增强,卵巢癌病灶中存在过度EMT,E-cadherin表达也明显减少、而N-cadherin及Vimentin表达也明显减少[13-14]。结合本实验的结果说明,白藜芦醇能够以剂量依赖性的方式调节离体培养的卵巢癌细胞中多种增殖基因的表达,进而使癌细胞的增殖受到抑制。

在卵巢癌的病理进程中,癌细胞内增殖基因表达的变化受到上游复杂信号通路的调控,其中Wnt信号通路对细胞周期基因及EMT基因均具有调控作用。依赖β-catenin途径是经典的Wnt信号通路,Wnt1、Wnt3a、Wnt5a是该途径的上游信号分子,通过与细胞膜上的受体Frd、LRP5/6等结合后使细胞内Axin/APC/GSK3β组成的复合体发生解离,同时也抑制复合体中GSK3β的表达,进而导致GSK3β对β-catenin的降解作用减弱、β-catenin在胞浆中大量蓄积并不断向细胞核转移。转移进入细胞核的β-catenin能够调节下游多种靶基因的表达。已有研究证实,Wnt通路在卵巢癌病灶内呈过度激活的状态,β-catenin的表达明显增多、而GSK3β的表达明显减少[15-16]。本实验对Wnt通路的研究结果显示:不同剂量白藜芦醇干预卵巢癌细胞24 h后,β-catenin的蛋白表达明显减少,GSK3β的蛋白表达明显增多,且白藜芦醇剂量越高,Wnt通路分子表达变化的趋势越明显,提示白藜芦醇能够以剂量依赖性的方式抑制Wnt通路的激活,这可能是白藜芦醇抑制卵巢癌细胞增殖、调节增殖基因表达的分子机制。

综上所述,白藜芦醇能够发挥抗卵巢癌作用,不同剂量的白藜芦醇能够以剂量依赖性的方式降低卵巢癌细胞的增殖活力、调节增殖基因的表达,且这一作用与Wnt信号通路激活的受抑制有关。