调强放疗联合DSOX方案化疗对晚期胃癌患者血清miRNA-17水平及预后的影响

刘小军, 莫秀娟, 高飞, 贾利, 王允, 代红春, 易光明, 韩建军, 贾霖, 钟海宇

胃癌是全球高发肿瘤之一,根据2018年公布的2000—2014年全球癌症生存率变化趋势监测研究报告显示,中国癌症患者中胃癌发病占比达到15.6%,仅次于肺癌位列第二位[1]。由于胃癌早期临床症状不典型,许多患者在就诊时已发展至晚期。目前临床上对晚期胃癌尚无有效治疗方案,通常进行姑息治疗以延长患者生存期,改善患者生存质量[2]。DSOX化疗是临床上对晚期胃癌常用的治疗方案之一[3-5],但其治疗效果不尽如人意。

近期有文献报道,放疗联合化疗可显著提高晚期胃癌的治疗效果,对患者生存质量的改善及生存时间的延长具有一定价值[6-7]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内生的、长度约为20～24个核苷酸的小分子非编码RNA。已证实miRNA具有广泛的基因调节功能,包括细胞的生长、分化、凋亡、迁移、侵袭等多个生物学功能[8-9]。近年分子机制研究指出,靶向抑制人胃癌高转移细胞株MKN28中miRNA-17水平可显著抑制胃癌细胞的侵袭与转移,miRNA-17被认为是胃癌治疗的重要分子靶标之一[10]。Wu等[11]研究发现靶向下调miRNA-17表达可抑制胃癌细胞发生上皮-间质转化,进而抑制胃癌细胞的转移和侵袭,且下调miRNA-17表达可增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性,促进癌细胞凋亡。以上研究均提示miRNA-17可作为评估胃癌患者肿瘤恶性进展的标志物。但关于调强放疗联合DSOX化疗对晚期胃癌患者血清miRNA-17水平的影响,及miRNA-17对晚期胃癌患者的预后评估价值均尚未见报道。本研究选取晚期胃癌患者96例,均分为两组后分别给予单独DSOX化疗及调强放疗联合DSOX化疗,比较两组患者的血清miRNA-17水平、治疗效果和生存时间,以期为晚期胃癌的治疗提供新方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象纳入与分组 收集2016年1月至2016年8月绵阳市第三人民医院收治的晚期胃癌患者96例,男58例,女38例,年龄37～64(57.4±8.3)岁。其中鳞癌64例,腺癌20例,腺鳞癌12例。胃癌的分期参照美国肿瘤联合会(American Joint Cancer Committee,AJCC)第七版TNM分期系统[12],并定义Ⅳ期为晚期。排除幽门梗阻及合并其他恶性肿瘤者。本研究经我院伦理委员会批准,所有纳入对象知情并签署同意书。采用随机数字表法将患者分为观察组与对照组,每组48例,其中观察组男25例,女23例,年龄39～64(58.3±8.0)岁;对照组男26例,女22例,年龄37～60(56.5±7.7)岁,两组间性别(χ2=0.042)和年龄(t=0.264)差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 治疗方案 两组患者均给予DSOX方案化疗:多西他赛75 mg/m2,奥沙利铂130 mg/m2,均于第1天持续静脉滴注;替吉奥胶囊40 mg/m2,于第1～14天口服,2次/d。21 d为1个周期,两组患者均治疗4个周期。观察组在此基础上给予调强放疗:患者固定于治疗床架后,设置体表标志并行薄层增强CT扫描定位,患者于平静呼吸下行强化薄层无间隔连续扫描。将所得CT图像传输至CMS-XIO调强治疗计划系统中,勾勒靶区及敏感器官轮廓,设定内边界值,摆位边界值,结合靶区处方剂量及敏感器官限量等计算出优选治疗计划。以96%等剂量曲线覆盖计划靶区进行治疗。

1.3 血清miRNA-17检测 所有患者在接受治疗前一天及治疗结束当天,抽取患者外周血10 ml,在1 h内于4 ℃条件下以12 000xg离心力(离心半径为10 cm)离心10 min,收集上层血清备用。按照血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行血清总RNA提取。取上述提取的RNA,使用去除基因组逆转录试剂盒逆转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qPCR)检测miRNA-17水平,检测试剂均购于康为世纪生物科技有限公司,qPCR反应体系为:Mix 10 μl,上下游引物各0.8 μl,cDNA 2 μl,DEPC水6.4 μl。循环条件为:95 ℃变性5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,45个循环。以U6为miRNA-17的内参。引物序列如下,miRNA-17上游:5′-TGACTTAACAGACCAGAA-3′,下游:5′-CTAGCTTATTGAATCCAT-3′;内参基因U6上游:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游:5′-GCAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′。采用2-ΔCt法计算miRNA-17的相对表达量,Ct值=miRNA-17 Ct值-U6 Ct值。本次实验中miRNA-17和U6基因熔解曲线峰型单一,未见非特异性扩增,见图1。

1.4 卡氏(Karnofsky,KPS)评分与疗效评估 所有患者在接受治疗前1天及治疗结束当天,由专业医护人员对患者进行KPS评分,KPS评分标准如下[8]:① 正常,无症状和体征,100分;② 能进行正常活动,有轻微症状和体征,90分;③ 勉强可进行正常活动,有一些症状或体征,80分;④ 生活可自理,但不能维持正常生活工作,70分;⑤ 生活能大部分自理,但偶尔需要别人帮助,60分;⑥ 常需人照料,50分;⑦ 生活不能自理,需要特别照顾和帮助,40分;⑧ 生活严重不能自理,30分;⑨ 病重,需要住院和积极的支持治疗,20分;⑩ 重危,临近死亡,10分;死亡,0分。

疗效评估标准参照实体瘤疗效评价标准[9]:① 完全缓解(complete response,CR):肿瘤完全消失且无新病灶出现,持续≥1个月;② 部分缓解(partial response,PR):肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积缩小≥50%并持续≥1个月,且其他病变无进行性加重;③ 稳定(stable disease,SD):肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积缩小<50%,或增大≤25%;④ 进展(progressive disease,PD):肿瘤最大直径和最大垂直直径乘积增大>25%。有效率(%)=(CR+PR)/总例数×100%;疾病控制率(%)=(CR+PR+SD)/总例数×100%;死亡率(%)=死亡人数/总例数×100%。

1.5 随访 于治疗后对患者进行24个月的电话随访,记录两组患者的生存时间。随访终点为:① 24个月内患者死亡;② 24个月内患者退出该项研究;③ 24个月随访结束。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后的KPS评分和血清miRNA-17水平比较 治疗前,两组患者的KPS评分和血清miRNA-17水平差异均无统计学意义(P>0.05),治疗后,观察组的KPS评分高于对照组,血清miRNA-17水平低于对照组,差异有统计学意义,见表1。

图1 miRNA-17(A)和U6(B)基因熔解曲线峰型

表1 两组患者治疗前后KPS评分和血清miRNA-17水平比较

2.2 两组患者的疗效比较 观察组的治疗有效率与疾病控制率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组患者的疗效比较

注：CR:完全缓解;PR:部分缓解;SD:稳定;PD:进展

1.3 生存分析 经24个月随访,共54例患者死亡,其中观察组19例,对照组35例,无失访。对照组患者的生存时间显著短于观察组,差异有统计学意义(χ2=10.076,P=0.002,图2A)。分别以观察组和对照组患者治疗结束后血清miRNA-17水平的中位数为截点将两组分为观察组低miRNA-17、观察组高miRNA-17、对照组低miRNA-17和对照组高miRNA-17四组。相比于观察组低miRNA-17,观察组高miRNA-17患者的生存时间显著缩短(χ2=7.612,P=0.006,图2B);相比于对照组低miRNA-17,对照组高miRNA-17患者的生存时间显著缩短(χ2=6.958,P=0.008,图2C)。

3 讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤。DSOX化疗是目前较常使用的化疗方案之一,而化疗联合放疗对晚期胃癌患者疗效显著[3]。本研究进一步证实,调强放疗联合DSOX化疗可显著提高治疗效果及患者生存质量,并延长患者生存时间。此外,本研究还发现,调强放疗联合DSOX化疗在靶向下调癌基因miRNA-17表达进而提高疗效中发挥重要作用。

已有文献报道miRNA-17在多种实体肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌等癌症中存在异常表达,且参与了肿瘤的发生与转移[13-15]。其中,miRNA-17在胃癌中的研究进展更值得关注。Valladares-Ayerbes等[16]在对38例胃肠癌(结直肠癌、胃癌和胰腺癌)患者的血清miRNA-17水平进行检测并随访发现,miRNA-17水平较健康对照显著增高,而多元Cox回归模型结果显示miRNA-17是患者肿瘤疾病进展(HR=2.11,P=0.003)和死亡(HR=2.62,P<0.001)的危险因素。值得注意的是,近期一项循证医学结合生物信息学的分析结果提示,miRNA-17可通过激活PI3K、Rap1、MAPK、cAMP等通路参与胃癌恶性生物学行为进程[17]。本研究发现,观察组和对照组中miRNA-17高水平患者的生存时间均显著低于各组中miRNA-17低水平患者,与前期的研究结果相符[16-17],这也提示miRNA-17水平对放化疗后患者的预后评估具有一定的价值。

相关的机制研究在miRNA-17参与胃癌进展中有探讨。Chen等[18]发现miRNA-17可通过靶向抑制抑癌基因早期生长反应因子2(EGR2)的表达,促进胃癌侵袭、转移和增殖,而在下调miRNA-17水平后,胃癌细胞中EGR2表达显著上调。Zhang等[10]也指出靶向下调miRNA-17表达可显著抑制胃癌细胞的增殖。上述结果均表明,靶向抑制miRNA-17可通过多途径抑制胃癌的发展,是胃癌治疗的重要靶标之一。本研究发现,调强放疗联合DSOX化疗较单独应用DSOX化疗可显著降低晚期胃癌患者的血清miRNA-17水平,随后的生存分析结果表明,低miRNA-17水平组患者的总生存率均高于高miRNA-17水平组,该结果与前期国内外报道相一致[10,18],表明调强放疗联合DSOX化疗可靶向抑制miRNA-17表达,进而提高疗效,改善患者预后。然而,本研究尚有以下不足之处:本次研究收集的病例数有限,未来仍需更大样本、多中心研究对本次研究结果进行验证;本研究未对调强放疗联合DSOX化疗靶向抑制miRNA-17表达的潜在机制进行深入挖掘,未来可设计相应的动物实验和细胞实验进行探究。

A:观察组与对照组的生存曲线比较;B:观察组高miRNA-17与观察组低miRNA-17的生存曲线比较;C:对照组高miRNA-17与对照组低miRNA-17的生存曲线比较图2 各组生存曲线比较

综上所述,调强放疗联合DSOX化疗可靶向抑制晚期胃癌患者体内miRNA-17表达水平,并进一步提高治疗效果,改善患者生存质量,有望为晚期胃癌患者的临床治疗提供新途径。