高锰酸钾甲苯胺蓝染色法对杯状细胞、肥大细胞、浆细胞、神经纤维的染色效果观察

丁桂龄，郑建明，刘艳芳

肠道不仅是机体消化吸收营养物质、产生相关激素的重要场所，还是机体发挥免疫功能的关键部位。这些功能的发挥依赖于很多特定的细胞、细胞特定的活性、细胞与细胞之间的相互作用等。研究发现杯状细胞、肥大细胞、浆细胞和神经纤维等形态结构和成分的变化，与上述功能的发挥密切相关。实际工作中单独显示上述组织的染色方法较多，然而用一种特殊染色方法同时显现上述组织却罕有报道。本科室经反复摸索，探索出高锰酸钾-草酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸组合染色法可以较好地同时显示上述组织结构，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取海军军医大学附属长海医院病理科送检的经外科手术切除的胰十二指肠切除标本、乙状结肠癌标本、横结肠癌标本、直肠癌标本各10例，所有标本均经10%中性福尔马林固定后取材，行常规流程制成3 μm厚石蜡切片，充分烤片。

1.2 主要试剂及配制(1)1%高锰酸钾硫酸：高锰酸钾1 g，蒸馏水95 mL，3%硫酸液5 mL。(2)2%草酸：草酸2 g，蒸馏水100 mL。(3)0.5%甲苯胺蓝：甲苯胺蓝0.5 g，蒸馏水100 mL。(4)丽春红苦味酸染色液：0.5%丽春红S水溶液10 mL，苦味酸饱和水溶液90 mL。

1.3 染色方法组织切片经脱蜡至水，0.5%高锰酸钾硫酸滴染10 min，自来水洗。2%草酸滴染1 min，自来水洗。0.5%甲苯胺蓝滴染30 min，自来水洗。丽春红苦味酸染色液滴染3 min。冷风干燥，中性树胶封固。

2 结果

杯状细胞呈边界清晰的亮白色空泡状(图1)；肥大细胞呈圆形或椭圆形，细胞核浅蓝色(图1、2)，胞质颗粒紫红色(图3)；浆细胞整体呈深蓝色，核蓝染呈圆形或半月形偏向一侧，胞质淡染(图4)；胶原纤维呈深粉红色、不规则、弯曲状分布(图1～4)；神经纤维呈淡粉红色，细胞核蓝色，规则条索状、波浪状排列(图4)。

3 讨论

杯状细胞、肥大细胞、浆细胞、神经纤维、胶原纤维等形态结构和成分的改变，与肠道相关功能的发挥密切相关。能同时显示上述组织结构的染色方法报道较少，本文提出的高锰酸钾-草酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸组合染色法，能较好地同时显示上述组织结构。

对于组织中杯状细胞、肥大细胞、浆细胞、神经纤维、胶原纤维的显示，传统染色方法是在不同的切片中分别显示或者不能完全同时显示；本文提出的组合染色法，可以在一张切片上同时显示以上组织结构。基于甲苯胺蓝对部分组织单一着色的原理，为达到较好的染色效果，组合染色流程中需注意以下几项：(1)染液的配制上选择了经硫酸酸化的高锰酸钾液，因为硫酸能加强肥大细胞胞质颗粒的异染性[1]，但要注意染液配制时的合适比例。(2)高锰酸钾的浓度从常规染色法中的0.5%提高到1%，既可以加强对组织的氧化反应，又使要显示的组织具有选择性，还可以改善背景色调。(3)草酸具有较强的还原性，可以对切片进行漂白和分化并优化背景色调；染色过程中，当肉眼观察到组织切片变白即可终止染色，否则组织容易脱落。(4)甲苯胺蓝属于具有异染性的碱性染料，含有2个发色团和2个助色团，助色团能促使染料电离成盐类，帮助发色团对组织产生染色力[2]。组织中的酸性物质与甲苯胺蓝中阳离子结合而使细胞核呈蓝色[3]，故对杯状细胞、肥大细胞、浆细胞和神经纤维的细胞核都有相应的着色。杯状细胞胞核深蓝色位于细胞底部、但整体成亮白色空泡状，可能是由于杯状细胞分泌物所含的成分与甲苯胺蓝并不反应或反应程度很低，以至于杯状细胞整体淡染甚至不着色。(5)丽春红苦味酸染色液的应用，可以同时显示胶原纤维和神经纤维；由于神经纤维有细胞核，经甲苯胺蓝作用，就很好地将两者区分开；此步骤染色后水洗时间不能过长，否则组织将褪色或着色不均。(6)染色结束后的切片需自然晾干或冷风干燥后封片。因为乙醇和二甲苯对甲苯胺蓝分别有分化作用和改变其异染反应的特点，如经乙醇脱水和二甲苯透明时间过长，甲苯胺蓝对组织的着色将会被乙醇洗脱和被二甲苯逆转。基于该组合染色的原理并不因组织的特异性而产生差异，该方法在其它含有上述成分的组织结构中同样适用。

综上所述，高锰酸钾-草酸-甲苯胺蓝-丽春红苦味酸组合染色法，既可以同时显示组织中含有的杯状细胞、肥大细胞、浆细胞、神经纤维和胶原纤维，又更具直观性，还解决了因分别染色的时空差异而导致判读困难的难题。