复合酶修饰对红薯淀粉分支结构和物化特性的影响

肖 瑀，郭 丽，邓银凤，王 懿，朱晨晨，杜先锋,*

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东 济南 250353）

红薯块茎中含有质量分数10%～30%的淀粉[1]，但是天然红薯淀粉在应用和加工上存在很多局限性：比如透明度差会直接影响到红薯淀粉产品的外观和可接受性；淀粉糊黏度过高不适合用于要求高浓度、低黏度的食品和化工行业；此外还有因溶解性差等而难以控制的缺陷[2]。因此，为了改善天然红薯淀粉的一些应用缺陷，并进一步扩大其应用范围，通常采用物理、化学或酶法对其进行分子结构修饰以提高加工性能，相较于物理和化学改性，酶法改性具有健康、绿色、环保且反应产物专一、反应条件温和等优点[3]。红薯淀粉中含直链淀粉（20%～30%，质量分数，下同）和支链淀粉（70%～80%）。许多研究表明支链淀粉的分支链结构对淀粉的物化特性具有至关重要的作用[4-8]，例如支链淀粉的短支链比例与溶胀能力、糊化焓和淀粉消化程度成正比，而与糊化温度和结晶度成反比。Guo Li等[9]发现，具有更高支化度和更多短链的支链淀粉不易被淀粉酶水解。为有效地修饰红薯淀粉的分支链结构，本研究首先将α-淀粉酶通过内切淀粉的α-1,4-糖苷键水解成较多的线性链，然后结合β-淀粉酶，通过从淀粉非还原性末端依次外切α-1,4-糖苷键，部分缩短外链长度，进一步生成更多的线性短链，最后利用葡萄糖苷转移酶将两种水解酶酶解后生成的线性短链通过α-1,6-糖苷键转糖基作用以生成新的分支点[10]，增加分支密度。本实验以红薯淀粉为原料，采用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶的复合处理调控红薯淀粉分支链结构，获得了不同分支密度和短链数的红薯淀粉，从而使红薯淀粉具备了不同物化性质，为开发具有一定亲水性、透明度、黏度和凝胶强度的红薯淀粉基产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红薯淀粉 四川友嘉食品有限公司；α-淀粉酶（酶活力50 U/mg）、β-淀粉酶（酶活力53 U/mg） 美国Sigma公司；葡萄糖苷转移酶（酶活力25 000 U/mL）日本天野酶制剂有限公司；普鲁兰酶（酶活力400 U/mL）丹麦诺维信公司；异淀粉酶（酶活力240 U/mg） 爱尔兰Megazyme公司；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ICS-5000分析型离子色谱系统 美国加州森尼维尔Dionex公司；NMI20-015V-I核磁共振成像分析仪 苏州纽迈电子科技有限公司；D8 Discover A25 X射线衍射仪德国布鲁克AXS公司；Nicolet IS50傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔公司；UV-5500紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；DHR-1旋转流变仪上海沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复合酶改性红薯淀粉的制备

将10 g红薯淀粉样品与200 mL（pH 6.9、0.02 mol/L）乙酸钠缓冲溶液在沸水浴中持续搅拌30 min。取出冷却至50 ℃，加入80 mgα-淀粉酶后，于50 ℃条件下水浴振荡8 h（100 r/min），然后沸水浴15 min终止反应。待样液温度冷却至37 ℃，使用0.02 mol/L乙酸缓冲溶液调节pH值至5.2，加入10.6 mgβ-淀粉酶后，于37 ℃条件下水浴振荡6 h（100 r/min），然后沸水浴15 min终止反应。将样液温度升温至55 ℃，使用0.02 mol/L乙酸缓冲溶液调节pH值至5.0，分别加入不同添加量（50、100、150、200、250、300 µL）的葡萄糖苷转移酶后置于55 ℃下水浴振荡10 h，然后沸水浴15 min终止反应。待样液冷却至室温，使用乙醇沉淀处理，3 000 r/min离心10 min，将沉淀冷冻干燥，即获得复合酶修饰后的改性红薯淀粉样品（W1、W2、W3、W4、W5、W6，分别对应不同添加量葡萄糖苷转移酶的样品）。通过不添加酶的酶改性淀粉制备流程获得对照样品。

1.3.2 直链淀粉比例和链长分布的测定

采用碘比色法测定直链淀粉比例[11]。采用高效阴离子交换色谱（high performance anion-exchange chromatography equipped with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法测定淀粉的链长分布[12]。将10 mg待测淀粉样品溶于2 mL体积分数90%的二甲基亚砜溶液，在沸水浴中持续搅拌20 min。待样液冷却至室温后，加入6 mL无水乙醇，3 000 r/min离心15 min，取出沉淀，加入2 mL pH 4.0、50 mmol/L乙酸钠缓冲溶液后，在沸水浴中持续搅拌20 min。然后使样液在40 ℃下达到平衡，加入5 µL异淀粉酶后，在40 ℃下缓慢搅拌24 h，最后沸水浴10 min终止反应，取400 µL样液，用150 mmol/L氢氧化钠溶液将其稀释至2 mL，0.45 µm滤膜过滤。将过滤后的样品注入ICS-5000 HPAEC系统，以1 mL/min的流速洗脱样品。流动相为150 mmol/L氢氧化钠溶液（洗脱液A）和含有500 mmol/L醋酸钠的150 mmol/L氢氧化钠溶液（洗脱液B）。将洗脱液B与洗脱液A混合，洗脱条件如下：0～15 min，15%～34% B；15～26 min，34%～40% B；26～52 min，40%～49% B；52～58 min，49%～100% B；58～60 min，100%～15% B；60～80 min，15% B。

1.3.3 分支密度的测定

采用质子核磁共振氢谱测定改性前后红薯淀粉的分支密度[13-14]。称取5 mg待测淀粉样品溶解在1 mL重水（D2O）中，沸水浴中持续搅拌30 min，然后冷却并冷冻干燥。再将冷冻干燥样品重新溶解在0.6 mL的D2O中。以潘糖作为标准品，在温度80 ℃条件下进行质子核磁共振光谱测定。α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的核磁共振光谱出峰位置分别在δ5.4和δ5.0确定。通过公式（1）计算分支密度。

式中：Sα-1,4和Sα-1,6分别是α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键的核磁共振光谱峰面积。

1.3.4 结晶结构的分析

淀粉的结晶特性使用X射线衍射仪测定。程序条件设定为：电压40 kV，电流200 mA，衍射角（2θ）的旋转范围为3°～40°，扫描速率为1.2°/min，步长0.02°。每个样品的扫描时间约为30 min[15]。

1.3.5 溶解度的测定

配制质量分数2%的淀粉乳液，在90 ℃恒温水浴30 min后，将其快速冷却至室温。然后在2 200 r/min、20 min的条件下进行离心。将上清液倒至培养皿中，并在105 ℃下干燥至恒质量。按照公式（2）[16]计算其溶解度。

式中：m1为可溶性淀粉质量/g；m2为样品总质量/g。

1.3.6 透明度的测定

配制质量分数1%的淀粉乳液，在沸水浴中不断加热搅拌30 min，待淀粉糊冷却至25 ℃，以蒸馏水作参比，使用紫外-可见分光光度计测定淀粉糊在640 nm波长处的透光率[17]。

1.3.7 流变特性的测定

配制质量分数6%的淀粉乳液，在95 ℃水浴条件下不断加热搅拌30 min，待其冷却至室温，即可进行测定，使用DHR-1旋转流变仪进行流变特性的测定。表观黏度与剪切速率的关系测定条件设定为：温度为25 ℃，剪切速率为0～300 s-1。储能模量和损耗模量与角频率的关系测定条件设定为：应变为1%，扫描频率为0.1～100 rad/s[18]。

1.4 数据处理与分析

所有实验测定均重复3 次。实验结果用平均值±标准差表示。采用Origin 7.5软件中Tukey’s检验进行单因素方差分析来确定数据差异的显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复合酶修饰对红薯淀粉直链淀粉比例和链长分布的影响

表 1 不同酶处理改性淀粉与对照样品的直链淀粉比例、链长分布Table 1 Amylose contents and chain length distributions of modified sweet photo starches

表1显示了所有样品的直链淀粉比例，经α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷转移酶依次处理后直链淀粉比例较对照组明显降低，且随葡萄糖苷转移酶添加量从50 µL增加至300 µL，直链淀粉比例从22.53%下降至12.81%，这个结果可能是因为复合酶的降解和分支作用，形成新的分支点，从而将直链淀粉转化为支链淀粉，因此降低了直链淀粉的比例。采用HPAEC-PAD测定了复合酶处理红薯淀粉的链长分布，结果如表1所示，根据链长的聚合度（degree of polymerization，DP）将链长分布划分为4 个部分：A链、B1链、B2链和B3链[19]。与对照组相比，经α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷转移酶修饰后淀粉的A链和B1链比例增加，而B2链和B3链的比例降低，并且随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加，A链和B1链的比例持续增加，B2链和B3链的比例则持续降低。当葡萄糖苷转移酶添加量增加至300 µL时，A链和B1链比例分别增加至40.25%和53.82%，B2链和B3链比例则分别减少到3.41%和2.52%。同时，经复合酶处理后淀粉的平均链长相比于对照组明显缩短，且随着葡萄糖苷转移酶添加量从50 µL增加至300 µL，平均链长从18.41逐渐下降至9.42。说明复合酶处理后，红薯淀粉的短链比例显著增加，平均链长显著降低。

2.2 复合酶修饰对红薯淀粉分支密度的影响

通过液态核磁共振氢谱法[20]深入研究红薯淀粉分支密度。淀粉的分支侧链是由α-1,4-糖苷键连接的线性链通过α-1,6-糖苷键链接α-D-吡喃糖基单元形成的。Hernández等[21]报道在δ5.4、δ5.0和δ4.8处的核磁峰分别代表α-1,4-糖苷键中端基质子、α-1,6-糖苷键中端基质子和水峰，而在δ3.3～4.5范围内的核磁峰则分别代表H-2、H-3、H-4和H-5。如图1所示，所有经α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷转移酶修饰后的红薯淀粉α-1,6-糖苷键峰面积明显大于对照样品，说明淀粉内部经葡萄糖苷转移酶作用存在着明显的链转移。且所有酶改性淀粉均比对照样品有着更高的分支密度，并随葡萄糖苷转移酶添加量的增加（从50 µL增加至300 µL），分支密度呈增加趋势（从21%增加至35%），与平均链长的变化规律相似。以上结果说明，先通过α-淀粉酶和β-淀粉酶水解天然红薯淀粉的α-1,4-糖苷键，从而使其外链长变短，产物的平均链长也随之减小，再通过葡萄糖苷转移酶的作用将游离的葡萄糖残基以α-1,6-糖苷键的形式连接到其他链上，形成了新的分支侧链，提高了分支密度。

图 1 不同酶处理改性淀粉与对照样品的质子核磁共振氢谱分析图Fig. 1 1H NMR analysis of native and modified starches

2.3 复合酶修饰对红薯淀粉结晶结构的影响

图 2 不同酶处理改性红薯淀粉与对照样品的X射线衍射图Fig. 2 X-ray diffraction patterns of native and modified starches

由图2可看出，天然红薯淀粉不仅在15.0°和23.5°附近出现两个强衍射峰，且在17.2°和18.2°出现两个连峰，并在19.7°处具有较低强度的峰，这是典型的CA-型晶体结构，与之前的研究结果[22]一致。由于淀粉糊化后，淀粉颗粒吸水膨胀凝胶化，因此对照样品没有衍射峰。然而，经α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖苷转移酶处理淀粉的衍射峰发生了较大变化，如图2所示，在23.5°处的原始峰消失，在15.3°、17.2°和18.3°处的原始峰强度变弱，这说明天然红薯淀粉晶型被完全破坏。但酶改性淀粉在13.1°处出现了新的衍射峰，并且在19.7°处的峰值也相对增加，这意味着被破坏的晶体结构可能重新排列成弱C型晶体结构，又由于13.1°和19.7°处的衍射峰是V型结晶结构的典型峰[23]，因此经复合酶修饰后的改性淀粉结晶结构为C+V型，而V型为主要晶型。与天然红薯淀粉相比，酶改性淀粉在19.7°处的较高峰强度可能是因为经复合酶修饰后的高分支淀粉具有更多的短直链葡聚糖，与无水乙醇的复合物有利于V型晶体结构的形成[24]。天然红薯淀粉的相对结晶度为38.8%，所有酶改性淀粉的相对结晶度均低于天然红薯淀粉，但酶改性淀粉的相对结晶度呈现出随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加而增加的趋势，从10.8%增加至14.8%，这是因为随着葡萄糖苷转移酶添加量增加，短直链葡聚糖也越多，其与无水乙醇的复合物有利于形成V型晶体结构，因此相对结晶度会增大。

2.4 复合酶修饰对红薯淀粉溶解度和透明度的影响

表 2 不同酶处理改性淀粉与对照样品的溶解度和透明度Table 2 Solubility and transmittance of native and modified sweet photo starches

所有样品的溶解度如表2所示，与对照样品相比，酶改性淀粉的溶解度显著提高，且随着葡萄糖苷转移酶添加量从50 µL增加至300 µL，溶解度从48.48%逐渐提高至66.15%。这个结果与先前的研究一致，Jensen[25]和Sievert[26]等指出，淀粉新分支点的引入会抑制直链淀粉的重结晶、葡聚糖链的重新排列以及高度有序支链淀粉簇的形成，使溶解度增加。此外，Takata等[27]的研究表明，具有低直链淀粉比例、高短链比例的高分支聚合物高度可溶。

如表2所示，透明度的变化规律与溶解度相似，相比于对照样品，酶改性淀粉的透明度明显提高，并随葡萄糖苷转移酶添加量从50 µL增加至300 µL，溶解度从61.72%逐渐提高至73.91%，这是因为复合酶修饰后直链淀粉比例减少，分支密度增加，当淀粉糊化后，分子间不易形成聚合作用[28]，从而抑制了淀粉回生后凝胶束的形成，因此提高了淀粉糊液的透明度。

2.5 复合酶修饰对红薯淀粉流变特性的影响

由图3可知，对照和酶改性淀粉糊的表观黏度随着剪切速率的增加而降低，而酶改性淀粉糊的表观黏度明显低于对照淀粉糊，这表明酶改性淀粉糊溶液为典型的剪切变稀流体，且比对照淀粉糊具有更大的剪切稀化能力。同时，酶改性淀粉糊的表观黏度随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加略微降低。酶改性淀粉糊表观黏度的降低可能是因为经复合酶修饰后直链淀粉比例相对较低，分支密度增加，导致直链淀粉间形成的缠结减少，并降低了聚合物凝胶网络的重建速度[29]，从而降低了黏度。此外，根据Li Wenwen[30]的研究结果，高分支密度会降低链间缔合，从而降低凝胶网络内接合区的含量，产生更大的剪切稀化能力。因此，随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加，分支密度越高，剪切稀化能力越大，表观黏度则越小。

图 3 不同酶处理改性红薯淀粉与对照样品的表观黏度随剪切速率变化曲线Fig. 3 Curves of apparent viscosity against shear rate for native and modified starches

图 4 不同酶处理改性红薯淀粉与对照样品的储能模量和损耗模量随角频率变化曲线Fig. 4 Curves of storage modulus and loss modulus against angular frequency for native and modified starches

对照和酶改性淀粉糊的储能模量（G’）和损耗模量（G”）随角频率的变化如图4所示，G’和G”分别用来表征淀粉糊的弹性特征和黏性特征。对照淀粉糊的G’和G”随角频率升高均呈规律性的逐渐增加，且在整个频率范围内G’始终远远大于G”，这表明对照淀粉糊表现出较弱的凝胶状行为[31]。酶改性淀粉糊的G’和G”曲线特征与对照淀粉糊相似，但明显低于对照样品，且随葡萄糖苷转移酶添加量的增加而逐渐降低，说明凝胶的刚性、强度和黏弹性随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加而明显下降。这是因为淀粉经复合酶修饰后，直链淀粉比例减少，分支点增加，使直链淀粉间不能有效地聚集形成三维凝胶网络结构。

3 结 论

使用α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶复合修饰红薯淀粉，与原红薯淀粉相比其分支密度增加，直链淀粉比例减少，平均链长降低，相对结晶度、表观黏度、储能模量和损耗模量降低，溶解度和透明度均有所提高。红薯淀粉物化特性还受到葡萄糖苷转移酶添加量的影响，实验表明随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加，表观黏度和黏弹性逐渐降低，溶解度和透明度则逐渐增大。这可能是因为在α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶的连续催化反应下，随着葡萄糖苷转移酶添加量的增加，产生了更多的分支点和更均匀的短支链淀粉，可能形成了具有相似链长且对称的短链分支，以促进淀粉有序结构的形成。