碳链长度及不饱合度对脂肪酸低场核磁弛豫特性的影响

成实

摘 要 对不同碳链长度及饱和程度的脂肪酸及二、三元混合脂肪酸体系的低场核磁共振弛豫特性进行了研究。结果表明，除乙酸外，随碳链长度增加，横向弛豫时间（T2）及单组分弛豫时间（T2W）均减小；而随不饱和度增加，二者均相对增大。对棕榈酸油酸、硬脂酸油酸混合体系而言，随着油酸比例增加，T2与T2W均增大；油酸比例大于40%后，会对亚油酸油酸体系的弛豫响应产生较大影响。随着亚油酸比例增加，各亚油酸油酸硬脂酸三元混合体系的T2弛豫时间均增大，峰面积比例（S21）减小，而峰面积比例（S22）增大，油酸比例越高，峰面积比例的变化幅度减小，T2W均增加，且随体系中油酸（OA）比例的增加变化趋缓。

关键词 脂肪酸； 链长； 不饱和度； 低场核磁共振； 弛豫特性

1 引 言

脂肪酸是组成脂质的脂肪族一元羧酸，其链长在 4～28 个碳之间，根据双键数目又可分为饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸。脂肪酸组成对脂质的理化性质、加工性能及生理功能都具有重要影响，因此，脂肪酸的分析是脂质研究的重要方面之一。目前主要采用气相色谱（GC）及气相色谱质谱联用（GCMS）[1]、近红外光谱（NIR）[2]及高效液相色谱（HPLC）[3]等方法对脂质中的脂肪酸组成进行分析。但由于GC、HPLC等方法的分析过程较为复杂，包括较多的样品前处理步骤及有机溶剂的使用，近红外光谱法虽具有无损、快速、无污染等优点，却需要大量有代表性且化学值已知的样品建立模型。加之脂肪酸组分较复杂，分析工作存在一些困难，因此仍有必要探索新型、高效、无损的脂肪酸分析方法，以期为加快脂肪酸分析技术的发展提供参考。

低场核磁共振技术（Lowfield nuclear magnetic resonance，LFNMR）是基于原子核磁性的一种波谱技术[4]， 1H LFNMR所获得的弛豫信息与样品内部氢质子的存在状态及所处物理化学环境有关。近年来，LFNMR技术因其快速、无损等特点，已在食品研究领域得到了广泛应用。而应用低场核磁技术测定固体脂肪含量（Solid fat content，SFC）是美国油脂化学家协会（The American Oil Chemists' Society，AOCS） 规定的标准方法之一[5]。Meiri等[6]对不同碳链长度及饱和度的脂肪酸甲酯的LFNMR弛豫特性进行了研究，发现随着碳链增长，脂肪酸甲酯的弛豫时间缩短，而不饱和度增大，其弛豫时间变长。Zhu等[7]和Zhang[8]等对不同食用油脂LFNMR弛豫特性的研究均表明，油脂的脂肪酸组成与其弛豫时间密切相关，横向弛豫时间（T2）分布表明存在着不同稳定比例的氢质子数。赵婷婷等[9]发现掺杂不同比例煎炸猪油后，食用猪油的LFNMR弛豫特性与脂肪酸组成变化存在良好的相关性。 Prestes等[10]认为脂肪酸不饱和度越高，油脂粘度越小，其弛豫时间越长，故不饱和脂肪酸弛豫时间大于饱和脂肪酸。Lu 等[11]分析了3种植物油的LFNMR弛豫图谱，认为弛豫时间短的峰代表饱和脂肪酸，弛豫时间长的峰代表不饱和脂肪酸。以上研究均表明脂肪酸的组成对脂类的弛豫特性有重要影响。Chen等[12]进一步应用LFNMR对油炸食品的弛豫响应规律进行研究，发现油、水响应可明显区分，且可应用该技术进行油炸食品中水油含量的快速分析。

基于以上分析，本研究重点对不同链长及饱和度的脂肪酸的LFNMR弛豫特性进行了研究，在此基础上对二、三元混合脂肪酸体系的LFNMR弛豫特性进行研究，以明确脂肪酸链长及饱和度对其弛豫特性的影响规律，为应用低场核磁技术进行脂质分析提供必要的研究基础。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LFNMR核磁共振分析仪（NMI20，氢谱，磁场强度（0.50 ± 0.08） T，共振频率21.3 MHz，配套Φ15 mm核磁试管和TInvfit反演拟合軟件，上海纽迈电子科技有限公司）；HHS21恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；XW80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）。

乙酸、丙酸为分析纯；正丁酸、正戊酸、正己酸、正庚酸、正辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸均为化学纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司。各脂肪酸的熔点（Tm）由生产商提供，见表1。

2.2 LFNMR横向弛豫时间（T2）检测条件

在室温下均为液态的C2～C9的脂肪酸的测量条件为：准确移取2.5 mL待测样品于核磁试管中，32℃水浴10 min，置于核磁探头中稳定1 min后，选择CPMG序列，在采样频率（SW）=250 kHz、重复扫描次数（NS）=4次、回波个数（Echo count）=15000 个、半回波时间（DL1）=0.5 ms、重复采样等待时间（TW）=15000 ms下采集信号；C10～C18饱和脂肪酸的Tm较高，在32℃时为固态，核磁共振弛豫信号较弱，因此，为了保证样品均呈液态，采集到有效信号，便于结果的比较，C10～C18脂肪酸的检测条件为：准确移取2.5 mL待测样品于核磁试管中， 85℃水浴10 min，回波个数（Echo count）=11000 个，重复采样等待时间（TW）=3000 ms，其它参数与C2～C9的脂肪酸的检测参数相同。

脂肪酸混合体系的检测条件与C10～C18脂肪酸的检测参数一致。

2.3 数据处理

利用Tinvfit软件对LFNMR测量得到的自由诱导指数衰减曲线进行反演拟合，得到样品的弛豫信息，如各峰的弛豫时间T2i （i = 1，2….）及其相应的峰面积比例S2i（i = 1，2….）、单组分弛豫时间T2W等。

每个实验设置3个平行样品，每个样品重复检测3次，以保证结果的可靠性。应用Excel软件对数据进行处理，用Origin8.0软件作图。endprint

3 结果与讨论

3.1 C2～C9脂肪酸体系的LFNMR弛豫特性

在相同温度下，當主磁场强度稳定时，T2分布与样品的内部化学结构密切相关。C2～C9脂肪酸体系的LFNMR弛豫特性如图1所示。

由图1A可知，各脂肪酸的LFNMR多组分弛豫图谱中均只出现了一个响应峰（T21），表明C2～C9脂肪酸内部氢质子的核磁响应均相对均匀， 但弛豫时间与碳链长度间有一定关联，除乙酸（T21=1232.85 ms）外，对C3～C9的脂肪酸而言，随脂肪酸C链长度增加，弛豫图谱整体左移，弛豫时间由1417.47 ms逐渐缩短至305.39 ms。这是由于短链脂肪酸分子会通过氢键而聚集，Iwahashi等[13]发现在363 K时，液态的壬酸（C9H18O2）实际上依然为二聚体，而Shinzawa等[14]的研究进一步表明，氢键在形成二聚类羧酸中起着重要的作用，氢键数量又与烷基链的长度成正比。所以，随碳链长度增加，氢键数量相应增多，分子间作用力加强，而其中所包含的氢质子自由度降低，弛豫相对加快，表现为弛豫时间缩短。乙酸则不同，Fathi 等[15]对乙酸结构的研究发现，乙酸体系中存在CHOC和OHOC两种类型的氢键，可以形成更多的分子间和分子内氢键，其体系中可能存在两种二聚体和两种三聚体形态，这使其中的氢质子的自由度相对降低，因此，与丙酸相比，其多组分弛豫时间相对较小。

单组分弛豫时间（T2w）是被测样品所含氢质子弛豫信息的平均值，可反映样品整体的LFNMR弛豫特性。由图1B可知，随碳链长度增加，T2W减小。因为随着碳链增加，脂肪酸的相对分子质量增大，整体的分子间作用力增强，布朗运动减弱，氢质子自由度降低，弛豫相对加快，表现为弛豫时间的缩短[16]。

3.2 C10～C18脂肪酸体系的LFNMR弛豫特性

从图2B可见，随着饱和脂肪酸碳链长度从C10∶0增加至C18∶0，T2W则从911.11 ms逐渐减小至475.92 ms，且硬脂酸与棕榈酸的T2W不同，T2W反映的是样品整体的LFNMR弛豫响应，硬脂酸与棕榈酸的相对分子质量有一定差异，从而使其单组分弛豫响应不同。饱和脂肪酸的CC键可自由旋转，烃链相对灵活，能够舒展成一条直线，使相邻原子的空间位阻最小，加之羧酸基团能形成氢键，因此羧酸常形成稳定的二聚体形式[17]，而脂肪酸分子间的范德华力则使二聚体结构更加稳固[18]。因此，随碳链长度增加，饱和脂肪酸二聚体更为紧密，对其中的氢质子的束缚力增强，使其多组分弛豫时间相对缩短。

比较硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）和亚油酸（C18∶2）的多组分弛豫图谱（图2A）可以发现，油酸（C18∶1）和亚油酸（C18∶2）的弛豫图谱中均存在2个响应峰，且随着不饱和度的增加，图谱整体右移。C18∶1和C18∶2的T21分别为265.61和292.13 ms，T22分别为613.59和824.63 ms。这是由于双键的存在导致直链发生扭结，干扰FAs结构的堆积[19]， 使整个体系的自由度变大，Iwahashi 等[20]对油酸分子结构的研究中亦发现，与硬脂酸的线性结构相比，油酸头部的羧基基团会形成分子间氢键，呈稳定且相对松散的叉指型结构。因而含双键较多的脂肪酸不具有刚性和固定结构，一般呈液态，分子间作用力减弱，弛豫时间相对增加，这从其T2W变化也可看出（图2B），与C18∶0相比，C18∶1和C18∶2具有明显较大的T2W值。另外，由于双键有屏蔽电子的作用，使其周围的氢质子电子云密度减小，与远离双键中心的氢质子的核磁响应有明显区别，氢质子在磁场内响应的不均匀度增大，从而出现了新的弛豫峰（T22），油酸T22峰的相对峰面积比例（S22）为73.8%，但对于亚油酸而言，共轭双键会形成π键，使电子云的分布趋向平均化，导致共轭分子中的单键的键长缩短，有利于体系形成相对紧凑的结构，使自由度相对较大的氢质子的比例降低，表现为S22相对减小（58.6%）。

3.3 二元脂肪酸混合体系的LFNMR弛豫特性

3种二元脂肪酸混合体系的多组分、单组分弛豫特性随油酸比例的变化情况如图3和图4所示。

由图3可知，对饱和脂肪酸与油酸形成的二元混合体系而言，即棕榈酸油酸、硬脂酸油酸混合体系（图3A和3B），随油酸比例的增加，二元FAs混合体系的弛豫图谱相对右移，弛豫时间逐渐增加，且在一定油酸比例时会出现新的弛豫峰（T22），具体而言，油酸比例为20%时，硬脂酸油酸体系的图谱中在705.48 ms出现了新的弛豫峰（T22）； 当油酸比例达到80%时，棕榈酸油酸体系在613.59 ms处出现T22峰，且S22随着油酸比例的增加而增大。这说明随着油酸比例增加，混合体系的核磁响应逐渐以含有双键的油酸为主导，分子间氢键及范德华力等作用力相对减弱，分子结构相对松散，氢质子在磁场内响应的不均匀度增大，且弛豫响应时间增大。而根据Inoue等[21]的研究，当两个脂肪酸的烷基链的长度不同时，整个体系会被填充得更加紧密。棕榈酸油酸混合体系形成的二聚体结构相对紧密，氢质子的自由度相对较低，因此，当油酸比例高达80%时才足以使T22峰呈现。

与前两个系列有所不同是，亚油酸油酸体系（图3C）的核磁响应是稳定的双峰，且当油酸比例低于40%时，体系核磁响应以亚油酸为主导，混合体系的弛豫时间及峰面积比例与单一亚油酸体系相近；当油酸比例大于40%后，油酸对混合体系弛豫响应的影响增大，使弛豫图谱相对左移，当油酸比例达到80%时，T21与单一油酸体系相同，均为265.61 ms，但峰面积比例仍与单一油酸体系明显区别，说明亚油酸对混合体系峰面积比例的影响相对较大。

由图4可知，3个脂肪酸混合体系的T2W的变化也有一定的规律。随油酸比例增大，硬脂酸油酸的T2W相对增大，且变化幅度最大，T2W从475.92 ms显著增加至781.03 ms； 其次为棕榈酸/油酸体系，油酸比例为20%时，其T2W较单一棕榈酸体系显著增大，而后变化相对较缓，当油酸比例大于60%后，又有较大的改变；而亚油酸油酸体系的T2W则随着油酸比例的增加而相对减小，尤其是在油酸比例大于40%后，T2W减小的幅度增大。endprint

3.4 三元脂肪酸混合体系的LFNMR弛豫特性

以不同配比的硬脂酸油酸体系为基础，向其中按比例添加亞油酸构成三元脂肪酸混合体系，各体系的多组分、单组分弛豫特性随亚油酸比例的变化情况如图5和图6所示。

由图5可知，亚油酸油酸硬脂酸（LAOASA）三元混合体系仍主要表现为典型的双峰特征，当硬脂酸与油酸的比例一定时，随分子结构相对松散的亚油酸比例的增加，各体系的弛豫时间均逐渐增大，图谱右移；与LA或OA/SA二元体系相比，弛豫峰分布区间变宽；且由于硬脂酸的弛豫特性与油酸、亚油酸有明显区别，因此，三元混合体系中硬脂酸比例越高，图谱整体变化幅度越大，以油酸硬脂酸（1∶4，V/V）（图5A）为例，不含有LA时，T21和T22分别为219.73和705.48 ms；含有40% LA时，T21和T22分别右移至257.92和932.60 ms，图谱分布范围增大；而图5D中，相同LA比例（40%）时，T21和T22分别为265.609和865.12 ms，分布区间明显变窄。另一方面，随LAOASA三元混合体系中LA比例的增大，体系的峰面积比例（S2i）也呈规律性变化。当LA比例从0%增加至20%时，S21增大，而S22减小，且OA比例越高，变化幅度越大，如图5A中S21从62.2%增加至100%，弛豫图谱仅表现为一个弛豫峰，而图5D中S21仅从35.3%增加至53.8%。当体系中的LA比例从20%逐渐增加至80%时，体系的S21减小，而S22增大，且OA比例越高，变化幅度相对减小，图5A中S22从0%增加至46.1%，而图5D中S22仅从46.2%增加至54.8%。这说明3种脂肪酸的混合体系中形成了更多形式的二聚体，使得体系中的氢质子的核磁响应发生了明显改变。

由图6可知，随体系中LA比例的增加，LAOASA三元混合体系的T2W均呈线性增加趋势。 且比较各系列的斜率可以发现，随体系中OA比例增加，斜率相对降低，依次为2.887、2.255、1.908和1.687，说明在LA比例相同时，随OA比例的增大，体系整体的不饱和键数量增加，使分子间氢键及范德华力等作用力相对减弱，分子结构更加松散，氢质子在磁场内整体的弛豫响应时间增大，表现为T2W的增大，这与多组分弛豫特性的变化相符。

4 结 论

主要研究了不同链长和饱和度的脂肪酸及二/三元混合脂肪酸体系的LFNMR弛豫特性，得到的主要结论如下：C2～C9 脂肪酸的多组分弛豫图谱（32℃）为典型单峰，C10～C14的饱和FAs表现为典型的双峰（85℃），而C16～C18的饱和FAs仅存在1个响应峰（85℃），C18∶1和C18∶2脂肪酸则为2个响应峰；除乙酸外，随C链长度的增加，脂肪酸弛豫图谱整体左移，弛豫时间逐渐缩短，T2W减小；而随不饱和度的增加，图谱整体右移。对棕榈酸油酸、硬脂酸油酸混合体系而言，随油酸比例的增加，图谱右移，一定油酸比例时会出现新的弛豫峰（T22），T2W相对增大；油酸比例大于40%后才会使亚油酸油酸体系的图谱相对左移，T2W减小。亚油酸油酸硬脂酸（LAOASA）的三元混合体系主要表现为典型的双峰图谱，随着LA比例增加，弛豫时间增大，图谱右移，弛豫峰分布区间变宽，且硬脂酸比例越高，变化越大，体系的峰面积比例（S2i）也呈规律性变化。研究表明，脂肪酸结构及混合比例的不同对其低场核磁共振弛豫特性有明显影响，可基于此规律应用低场核磁技术进行脂肪酸的快速分析。

References

1 Zhao R， Chu L， Wang Y， Song Y， Liu P， Li C， Huang J， Kang X. Clin. Chim. Acta， 2017， 468： 120-125

2 Chiesa L， Panseri S， Bonacci S， Procopio A， Zecconi A， Arioli F， Cuevas F J， MorenoRojas J M. Food Chem.， 2016， 212： 296-304

3 Zeng Z， Jia Z Y， Hu N， Bai B， Wang H H ， Suo Y R. J. Chromatogr. B， 2017， 1064： 151-159

4 Blümich B， Perlo J， Casanova F. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc.， 2008， 52（4）： 197-269

5 AOCS Official Method Cd 16b93； ISO 82921

6 Meiri N， Berman P， Colnago L A， Moraes T B， Linder C， Wiesman Z. Biotechnol. Biofuels， 2015， 8（1）： 96-107

7 Zhu W R， Wang X， Chen L. Food Chem.， 2017， 216： 268-274

8 Zhang Q， Saleh A S M， Shen Q. Food Bioprocess Tech.， 2013， 6（9）： 2562-2570

9 ZHAO TingTing， WANG Xin， LIU BaoLin， LU HaiYan. Food Science， 2015， 36（1）： 6-12

赵婷婷， 王 欣， 刘宝林， 卢海燕. 食品科学， 2015， 36（1）： 6-12

10 Prestes R A， Colnago L A， Forato L A， Vizzotto L， Novotny E H， Carrilho E. Anal. Chim. Acta， 2007， 596（2）： 325-329endprint

11 Lu R， Zhou X， Wu W， Zhang Y， Ni Z. Appl. Magn. Reson.， 2014， 45（5）： 461-469

12 Chen L， Tian Y Q， Sun B H， Wang J P， Tong Q Y， Jin Z Y. Food Chem.， 2017， 233： 525-529

13 Iwahashi M， Kasahara Y， Minami H， Matsuzawa H， Suzuki M， Ozaki Y. J. Oleo Sci.， 2002， 51（3）： 157-164

14 Shinzawa H， Iwahashi M， Noda I， Ozaki Y. J Mol. Struct.， 2008， s883-884（1）： 27-30

15 Fathi S， Bouazizi S， Trabelsi S， Gonzalez MA， Bahri M， Nasr S， BellissentFunel M. J. Mol. Liq.， 2014 ， 196（31）： 69-76

16 Nicolaas B， Purcell E M， Pound R V. Phys. Rev.， 1948 ， 73（7）： 679-712

17 Shinzawa H， Jiang J H， Iwahahsi M， Ozaki Y. Anal. Sci.， 2007， 23（7）： 781-785

18 Iwahashi M， Kasahara Y， Matsuzawa H， Yagi K， Nomura H， Terauchi H， Ozaki Y， Suzuki M. J. Phys. Chem. B， 2000， 104（26）： 6186-6194

19 Abramovic H， Klofutar C. Acta Chim. Slov.， 1998 ， 45（1）： 69-77

20 Iwahashi M， Kasahara Y. Curr. Opin. Colloid Interface Sci.， 2011， 16（5）： 359-366

21 Inoue T， Hisatsugu Y， Ishikawa R， Suzuki M. Chem. Phys. Lipids， 2004， 127（2）： 161-173

Abstract The chemical structure of fatty acid has a great influence on the relaxation characteristic of lipid. In this work， the lowfield nuclear magnetic resonance （LFNMR） relaxation characteristics of fatty acids with different chain lengths or degree of saturation were investigated firstly， and then the relaxation characteristics of binary or ternary fatty acid mixtures were studied. The result showed that except acetic acid， the T2 relaxation time and T2W decreased as the carbon chain length increased； but as the unsaturated degree increased， these measures all increased. For the binary fatty acid system， the T2 relaxation time and T2W of palmitic acidoleic acid and stearic acidoleic acid all increased as oleic acid ratio increased. While for the linoleic acidoleic acid system， only when the oleic acid ratio was above 40%， the relaxation response changed significantly. For the ternary fatty acid system， the T2 relaxation time of each linoleic acid/oleic acid/stearic acid system increased with the increase of linoleic acid ratio， while the area ratio S21 decreased， and S22 increased. The higher ratio of oleic acid and the change of the peak area ratio were relatively reduced， and the relative increases of T2W changed more slowly.

Keywords Fatty acid； Chain length； Degree of unsaturation； Lowfield nuclear magnetic resonance； Relaxation characteristics

（Received 1 July 2017； accepted 28 November 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31201365）.endprint