热烫拉伸融化过程对Mozzarella干酪品质、分子间作用力及微观结构的影响

李红娟，王 祎，刘 燕，于洪梅，李洪波，于景华*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

中国的干酪市场从2009年的不到2万 t迅速增加到2017年10.8万 t，年均增长率达到30%。其中77%的比例为餐饮渠道，尤其是作为披萨配料的Mozzarella干酪在中国消费量逐年增长，因此Mozzarella干酪具有广阔的开发应用及市场前景。Mozzarella干酪的功能性质（如未融化时的弹性、硬度和切条性以及融化时的融化性和拉伸性等）[1]对生厂商、加工商及消费者而言都非常重要，因此，系统地对Mozzarella干酪质构及功能特性进行研究，对其贮藏、加工都具有重要的实际应用价值[2-3]。

热烫拉伸是Mozzarella干酪在加工过程中区别于其他干酪的独特工艺，通过热烫拉伸Mozzarella干酪能够使其中蛋白质进行分子重排，干酪中蛋白质由无定型三维结构转变成线性纤维状网络结构，乳清和脂肪液滴填充在酪蛋白纤维束之间，干酪由刚性结构转变为塑性结构[1]。前人研究发现，在热烫拉伸过程中可能是由于干酪蛋白质分子中氢键、疏水作用力及静电斥力等发生变化，最终导致Mozzarella干酪拉丝特性形成[4]。Lucey等认为酪蛋白分子间的相互作用是造成干酪物理和化学变化的主要因素[5]。随着温度升高，疏水作用逐渐增大，这导致酪蛋白粒子间接触面积减少（酪蛋白粒子收缩），因此降低了整体的凝胶强度；随着温度升高，氢键吸引力逐渐降低，静电斥力增强，这些都导致斥力增加及基质变软[6]。可以将拉伸的酪蛋白分子看作聚合物（如纤维），其在高温下会变黏稠。如果酪蛋白网络在蛋白酶的作用下过分水解，拉伸性能会减弱。如果蛋白分子间的作用力过强（拉伸温度较低或者过多的钙结合在酪蛋白分子上），拉伸就会受损，凝胶结构会被破坏。氢键相互作用力对稳定蛋白结构也非常重要，随着温度升高，氢键作用力逐渐减弱，静电排斥力增强[7]。总之，热处理通过影响蛋白分子间作用力，导致蛋白质局部结构坍塌和转变，其中也包括有限变性作用，进而引起干酪整体固相胶体特性的改变。

热烫拉伸处理是Mozzarella干酪制作工艺中最为独特的一步，与干酪成熟后的功能特性密切相关[8]。目前关于热烫拉伸对干酪的加工效果已经有一些报道，但是，由于不同研究者的研究方法和手段不同，所以目前研究结果未对热烫、拉伸及干酪融化、融化后拉丝这几个过程对干酪的品质影响做出全面的解释[9-10]。因此，本实验主要研究了Mozzarella干酪制作过程中分别经过热烫、热烫拉伸处理的非完整工艺和完整工艺样品，及样品融化、融化后拉丝对干酪组分、功能特性、结构和分子间作用力的影响。系统性地探究热烫、拉伸对干酪品质影响及成品干酪融化、拉丝前后样品的变化特点，进一步阐明热烫拉伸同干酪品质及功能特性的相关规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

经过标准化处理的鲜牛乳 沧兴牧业有限公司；硫酸钾、氯仿、氢氧化钠、硫酸铜（均为分析纯）天津市化学试剂一厂；氯化钾、浓硫酸、戊二醛（均为分析纯） 天津市景田化工；石油醚 天津市富宇精细化工有限公司；Stamix 1150 NB凝乳酶（酶活力1 150 IMCU/g）、SYC-11型干酪发酵剂 丹麦科汉森公司；食盐（食品级） 山东寒亭第一盐场。

1.2 仪器与设备

HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；K9840凯氏定氮仪 济南海能仪器有限公司；SU1510扫描电子显微镜 日本日立公司；TA.XT Plus物性测试仪 英国Stable Micro Systems公司；DSC204 F1型差示扫描量热仪 德国Netzsch公司。

1.3 方法

1.3.1 Mozzarella干酪制作与样品准备

原料乳→杀菌（63 ℃、30 min）→冷却至37 ℃左右加入菌种（0.1 g/L）发酵→pH 6.4左右加入凝乳酶（0.03 g/L）→凝乳25～30 min左右切割→排乳清→堆酿→盐渍→不经热处理（样品点I）/只热烫处理（样品点II）/热烫拉伸处理（热烫温度70～75 ℃）（样品点III）→冷却→真空包装→成熟（成熟后的热烫拉伸干酪再进行融化（样品点IV）/融化后拉丝处理（样品点V）

1.3.2 干酪理化指标的测定

蛋白质量分数的测定参考GB/T 5009.5ü2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪质量分数的测定参考GB 5420ü2010《食品安全国家标准 干酪》；水分质量分数的测定参考GB/T 5009.3ü2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；pH值参考李红娟等的方法[11]测定。

1.3.3 干酪质构的测定

将4 ℃贮存的干酪样品切成边长1.5 cm的正方体，纤维方向垂直于压缩盘。质构仪参数设定：测试前探头下降速率5.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后探头回程速率5.0 mm/s，下压变形40%，触发力20 g，探头类型P/35[12]。

1.3.4 干酪融化、拉丝及油脂析出性的测定

1.3.4.1 干酪融化性测定

将干酪样品切成直径18 mm、厚7 mm的圆柱状（纤维方向垂直于干酪圆柱体直径），放于预先铺有9 cm滤纸的培养皿中，室温下放置30 min，然后将其放入100～103 ℃的烘箱内，加热1 h后取出，室温下回复30 min，分别从4 个方向测定融化干酪的直径，每个样品做3 个平行，取平均值，表示干酪的融化性[13]。

1.3.4.2 干酪油脂析出性的测定

将干酪样品切成直径18 mm、厚7 mm的圆柱状（纤维方向垂直于干酪直径），处理步骤同1.3.4.1节，室温下回复30 min，析出的油渗透在滤纸上形成油圈，分别从4 个方向测定油圈的直径，每个样品做3 个平行，取平均值，表示干酪的油脂析出性[14]。

1.3.4.3 干酪拉丝性的测定

样品切成直径3.5 cm、厚1 cm的圆柱，放置于预热到（200f5）℃的烤箱内，加热5 min后取出，使用叉子匀速挑起融化的干酪样品至其拉丝断裂，断裂时长度即作为干酪的拉丝性指标。每个样品至少做3 个平行，取平均值[15]。

1.3.5 干酪蛋白溶解度的测定

溶解液制备：1）pH 7.0的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；2）pH 7.0 PBS中加入体积分数2% 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-ME）；3）pH 7.0 PBS中加入质量分数2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）；4）pH 7.0 PBS中加入质量分数2% SDS和体积分数2% 2-ME。

干酪样品于研钵中捣碎，冷冻干燥成粉末。准确称取干酪粉末0.5 g（精确至1 mg）各4 份，分别加入10 mL上述不同4 种溶解液，使用振荡器常温下振荡20 min，离心，取上清液。沉淀中再分别加入10 mL上述4 种溶解液，重复浸提，离心，合并两次上清液于50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，得到样品蛋白质溶解液。溶解液中的蛋白含量用凯氏定氮法[16]测定。样品中总蛋白质量测定方法同1.3.2节。溶解度按下式计算。

1.3.6 荧光光谱法对干酪分子间疏水作用力测定

采用荧光光谱法测定干酪的疏水作用。根据固体表面荧光光谱法，利用色氨酸作为内源探针，将干酪装入固体样品池中，激发光源与样品检测器在样品一侧呈45°角，可以确保反射光、散射光和去偏光对样品测定的影响降到最低。激发和发射狭缝宽度分别为3.0 nm和1.5 nm，激发波长322 nm，扫描发射波长350～600 nm。

1.3.7 干酪玻璃化转变温度Tg的测定

取5～20 mg样品放入坩埚中压片，用差示扫描量热仪进行测定。具体检测方法如下：室温迅速降温至-60 ℃，保持20 min，升温至-20 ℃，保持30 min，降温至-60 ℃，保持20 min，升温至60 ℃[17]，升温及降温速率均为5 ℃/min。

1.3.8 干酪微观结构的测定

延干酪纤维方向切成表面平整的纤薄小片，浸于体积分数2.5%戊二醛溶液中，4 ℃下固定3～4 h，用pH 7.2的PBS清洗3 次，每次15 min，再分别用体积分数30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液梯度脱水，每次15 min，之后再用氯仿脱脂3 次，每次15～20 min，脱脂后用100%乙醇脱水3 次，每次15 min。样品处理好后放入-40 ℃冰箱冷冻2 h以上，然后取出放入冷冻干燥器中冷冻干燥。将干燥后的样品取小块粘在实验台上，采用离子溅射的方法喷金，置于扫描电子显微镜下扫描观察[18]。

1.4 数据处理与分析

以上实验中每个样品分别取样重复测定3 次，采用SPSS软件通过邓肯氏多重比较进行显著性分析，P＜0.05时表示差异显著，并用Origin 8.0软件进行数据拟合和作图。

2 结果与分析

2.1 热烫拉伸处理对干酪基本理化指标的影响

表 1 热烫拉伸对干酪基本理化指标的影响Table 1 Effect of thermal and stretching treatment on physiochemical indexes of cheese

干酪样品在经过7 d成熟期后测定其基本成分，由表1可知，未处理干酪凝块水分质量分数最低，为42.23%，随着热烫和拉伸水分质量分数逐渐增大，Mozzarella干酪样品中水分质量分数为48.70%，相对于样品点I增加15.3%。蛋白质量分数也随热烫拉伸处理过程逐渐增大，Mozzarella干酪样品比样品点增加15.1%。脂肪质量分数随着热烫拉伸处理而逐渐降低，Mozzarella干酪样品比样品点I和样品点II脂肪含量分别减少30.1%及15.1%。干酪凝块在未经过热烫拉伸前其水分质量分数很高，但由于蛋白结构排列较为疏松，锁水能力较差，因此，在成熟期间，会有相当一部分水从体系中流出，导致其水分质量分数较低。而经过热烫拉伸的干酪蛋白结构更加紧密，脂肪和乳清被蛋白纤维包裹，不易在成熟过程中流出，说明热烫拉伸过程能提升干酪的持水力[19]。干酪经过热烫拉伸后脂肪质量分数显著下降，说明较高温度的热烫及拉伸会使部分脂肪液化游离出来，尤其是大的脂肪团，从而降低了干酪中的脂肪含量[20]。

2.2 热烫拉伸处理对干酪质构特性的影响

表 2 热烫拉伸处理对干酪质构特性的影响Table 2 Effect of thermal and stretching treatment on texture properties of cheese

由表2可知，与未处理的干酪凝块相比，只经过热烫处理的干酪（样品点II）硬度增加，但其他质构特性（弹性、黏聚性、回复性、胶着度及咀嚼度）均下降。与样品点II相比，经过热烫拉伸的Mozzarella干酪样品的硬度、弹性、黏聚性、回复性、胶着度及咀嚼度都有所提高。热烫处理使固态脂肪液化，导致蛋白结构坍塌，但没有新的剪切力或拉伸力等外力促使已经被破坏的蛋白质基质形成新的稳定结构。而拉伸处理提供了一种能够重塑蛋白质基质的外力，使得酪蛋白由原来的网状结构转变成纤维结构，排列更加紧密，蛋白分子间的作用力也有所增加[21-22]。

2.3 热烫拉伸处理对干酪融化、拉丝及油脂析出性的影响

表 3 热烫拉伸处理对干酪功能特性的影响Table 3 Effect of thermal and stretching treatment on functional properties of cheese

由表3可知，经热烫及拉伸处理后干酪的融化性逐渐降低。同样品点I相比，样品点II和样品点III融化性分别下降0.23 cm及0.34 cm。样品在未经拉伸前，在样品点I和样品点II，油脂析出性均大于9 cm，经拉伸处理后油脂析出性降低。不同样品间拉丝长度无显著性差异。融化性和油脂析出性的变化同干酪样品的脂肪含量密切相关，样品点III融化性及油脂析出性的降低，主要由于干酪样品中脂肪含量减少造成。样品点I拉丝长度为44.25 cm，样品点III拉丝长度为42.87 cm，两者在长度上无显著差异，但是拉丝强度有明显区别（观察法得出，数据未在文中给出），样品点I同样品点III相比拉丝强度较弱，易断。样品点III干酪融化后大部分干酪能够黏连，可以大片拉丝，而样品点I只有少部分干酪在拉伸过程中黏连。这主要是由于未经热烫拉伸处理的干酪凝块蛋白质结构为松散的网状结构，乳清和脂肪随意地填充在蛋白质矩阵中，而融化时随着脂肪的液化蛋白质矩阵坍塌，结构流动性增强，因此能够有较长的拉伸长度，但是强度较弱[23]。干酪凝块在热烫处理后，高温使得脂肪液化，蛋白网络结构坍塌，但没有外力作用，未形成有序的结构，脂肪和乳清也较随意的分布[24]。经热烫拉伸处理后，蛋白质由原来较为松散的网状结构转变为纤维状结构，乳清和脂肪也随着蛋白质结构的改变而形成一条条顺着纤维方向的乳清脂肪通道，蛋白质形成更加紧密的结构，蛋白分子间作用力增强，因此当升温融化时，蛋白矩阵由于连接紧密，拉伸时能够有较好的强度[25]。

2.4 热烫、拉伸、融化及拉丝过程对干酪蛋白质溶解度的影响

不同处理对干酪蛋白质溶解度的影响结果如图1所示。未处理的干酪在PBS中的蛋白溶解度为67%左右，经过热烫、拉伸、融化和拉丝的干酪在PBS中的蛋白质溶解度有所提升，但在其余几种溶液中的溶解情况不一。

图 1 不同干酪样品的蛋白质溶解度变化Fig. 1 Effect of different treatments on protein solubility of cheese

未处理的干酪凝块在PBS+2-ME的溶液中溶解度与PBS溶液组相比明显增加，在PBS+SDS溶液中的溶解度有所提高，在PBS+2-ME+SDS溶液中的溶解度比只加SDS溶液的溶解度要低。说明未处理干酪凝块维持酪蛋白空间网络结构的主要作用力是氢键和疏水作用。经过热烫处理的干酪在PBS+2-ME和PBS+SDS溶液中的溶解度明显增加，说明干酪在经过热烫后，蛋白质空间结构发生变化，此时，二硫键和非共价键（疏水作用和氢键）对维持干酪蛋白空间结构有一定作用，当这些化学键被破坏时能够引起蛋白溶解度提高。经过热烫拉伸的干酪在PBS+2-ME+SDS溶液中蛋白质溶解度与在PBS中的溶解度无明显变化，说明此时二硫键和非共价键作用都较为微弱，蛋白质网络结构变得更加有序，因此当这些化学键被破坏时对蛋白质溶解度影响较小。经过融化后的干酪在PBS+2-ME溶液中的溶解度降低，在PBS+SDS溶液中的溶解度有所上升，在PBS+2-ME+SDS溶液中的溶解度明显增加，说明两种溶剂在一起具有明显的协同作用，表明蛋白结构在这一过程中可能发生了巯基和二硫键的转化。经过拉丝的干酪在PBS+2-ME溶液中的溶解度较高，而在含SDS的两种溶液中的溶解度明显下降，甚至低于在PBS中的溶解度。说明此时的酪蛋白结构主要通过二硫键维持蛋白结构。

2.5 热烫、拉伸、融化及拉丝过程对干酪分子间疏水作用力的影响

图 2 不同处理对干酪荧光强度的影响Fig. 2 Effect of different treatments on fluorescence intensity of cheese

如图2所示，各种处理所得干酪的最大荧光强度无明显差异，说明热烫、拉伸、融化以及拉丝处理不影响蛋白分子间的疏水作用。

2.6 热烫、拉伸、融化及拉丝处理对干酪Tg的影响

图 3 不同处理对干酪Tg的影响Fig. 3 Effect of different treatments on Tg of cheese

如图3所示，未经处理的干酪的Tg为-14.1 ℃，热烫后的干酪的Tg为-13.1 ℃，热烫拉伸后的干酪的Tg为-12.6 ℃，融化后的干酪的Tg为-13.8 ℃，拉丝后的干酪的Tg为-11.9 ℃。

未经处理的干酪蛋白网络结构松散，分子间的相互作用也较弱，因此，酪蛋白分子所受束缚少，运动性强。而经过热烫后，蛋白网络结构融化后处于将要重排却未能重排的状态，蛋白分子间的作用力也发生变化，蛋白分子的运动性减弱[26]。干酪再经过拉伸后，蛋白网络重排，由较为松散的三维网状结构转变为紧密的纤维状结构，蛋白分子链更加紧密，分子间作用力增强，蛋白分子的运动性减弱。成熟的干酪经过200 ℃高温融化后测定其Tg，可以发现融化后的干酪差示扫描量热曲线波动很大，可能是由于融化后的干酪组织结构塌陷，蛋白质、水分、脂肪等分布不均匀，分子束缚减小，运动空间增大；因此，分子运动性上升。但干酪高温融化后又进行拉丝，经过拉丝的干酪Tg明显升高，主要由于高温融化拉丝处理使得部分脂肪和水分从蛋白质基质中转移至干酪表面，蛋白质纤维间隙极小；故蛋白分子运动性下降。

2.7 热烫、拉伸、融化及拉丝处理对干酪微观结构的影响

图 4 不同处理对干酪微观结构的影响Fig. 4 Effect of different treatments on microstructure of cheese

由图4a可以看出，未经处理的干酪蛋白孔隙小、多而密集，蛋白网络结构表面有许多蛋白凸起，蛋白结构较为杂乱，但可以看出蛋白网络结构较为膨胀，乳酸菌大都被包裹在蛋白质基质中。由图4b可以看出，经过热烫处理的干酪蛋白孔隙变大、数量增多，部分纤维状结构，部分三维网状结构，乳酸菌部分在蛋白质基质外，部分被包裹在蛋白质基质中[27]。由图4c可以看出，干酪经过拉伸后，蛋白结构明显地呈现纤维状或长链结构，乳酸菌也从蛋白质基质中逐渐游离出，生长在蛋白质基质表面或乳清蛋白通道的孔隙中。如图4d所示，成熟后的干酪经过高温融化处理后，蛋白网络结构坍塌，乳清和脂肪随孔隙流失；因此，整个融化后的干酪呈现出孔隙多且大小不一的扁平状结构，乳酸菌也随之流出，分布在孔隙周围，成团地附着在蛋白质基质上，这主要是由于高脂肪的干酪中，丰富的脂肪液滴存在于蛋白质基质中，形成了蛋白网络中结构较为松散的点，导致蛋白结构随脂肪的变化而变化[16,28]。由图4e可知，融化后的干酪拉丝后会使干酪呈现出细长条的纤维结构，各个蛋白纤维间的蛋白连接很弱，蛋白质基质上的孔隙消失，乳酸菌均匀地附着在长的蛋白纤维上[29-30]。

3 结 论

本实验分别选取Mozzarella干酪在制作过程中干酪凝块（样品点I）、只热烫（样品点II）、热烫拉伸（样品点III）作为样品，对这3 个阶段的样品进行脂肪、蛋白质及水分等基本成分测定，并对其质构特性及加工特性（融化性、拉丝性及油脂析出性）进行研究；同时对成品Mozzarella进行热烫（样品点IV）和热烫拉伸后（样品点V）进行取样，研究其作用力及微观结构变化。通过干酪基本成分测定，发现与未经热烫拉伸的干酪相比，经过热烫和拉伸的干酪的水分质量分数和蛋白质量分数显著增加，脂肪质量分数下降，说明热烫拉伸能增强酪蛋白分子的锁水能力，但在这一过程中会有部分脂肪损失。脂肪的损失对于成品Mozzarella干酪的质构特性及加工特性都有一定的影响，在热烫拉伸过程中，干酪的油脂析出性和融化性相对于未处理的干酪有所降低。但在热烫拉伸后，分子间作用力增强。在Mozzarella干酪制作过程中，通过荧光光谱对分子间疏水作用力进行测定，发现热烫拉伸处理对蛋白疏水作用并无显著影响，结合干酪在不同溶液中的溶解度变化可以推测未处理干酪的蛋白结构主要靠氢键维持，对于热烫、拉伸和融化的干酪来说由共价键和非共价键共同维持，而对于拉丝的干酪则主要通过二硫键维持。说明经过热处理后分子间氢键不断减少，同时蛋白链排列更加有序，导致分子运动性降低，从而导致干酪的融化性下降。