丹皮酚对β-1,3-葡聚糖诱导的小鼠巨噬细胞Dectin-1/NLRP3信号通路抑制作用研究①

吴嘉迪 段强军 肖 楠 汪天明 邵 菁 吴大强 颜贵明 汪长中

(安徽中医药大学，合肥 230000)

酒精性肝病(alcohol liver disease,ALD)是临床上常见的肝脏疾病，该病主要是由于长时间大量酒精刺激引发的肝脏炎症损伤，表现为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化及肝硬化，甚至肝功能衰竭。因此，ALD已经成为需要迫切解决的公共卫生问题，如何防控ALD具有重要的现实意义。

丹皮酚(Paeonol，Pae)又称牡丹酚，为中药毛茛科植物牡丹、芍药和萝摩科植物徐长卿中提取分离出来的药效成分[1]。现代研究表明，丹皮酚具有良好的抗炎、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤等药理作用，且毒副作用小，目前在临床上应用广泛，主要应用于治疗血栓、动脉粥样硬化、酒精性脂肪肝病[2,3]。另外，丹皮酚的口服和注射给药对炎症/疼痛相关的适应证有效，例如头痛、神经痛、肌肉疼痛、类风湿关节炎；丹皮酚的外用制剂可用于多种皮肤疾病，例如湿疹、皮炎、皮肤瘙痒、蚊虫叮咬、对过敏性鼻炎和感冒也有一定作用[2]。因此，丹皮酚具有防治多种疾病的潜能。

随着近年来 “肝-肠”轴理念的成熟，肠道菌群失调在ALD中作用日益显著[4]，尤其是肠道真菌群。有研究表明，长期酒精刺激，使得肠道真菌失调，特别是白色念珠菌过度定植，增加肠黏膜通透性[5]，β-1,3-葡聚糖作为真菌细胞壁的主要成分之一，其通过肠屏障转运到肝脏，与肝巨噬细胞表面受体Dectin-1结合活化经典 NLRP3/ASC/caspase-1途径，通过Syk激酶使NLRP3自身寡聚，并募集接头分子ASC，后者募集并催化caspase-1前体(pro-caspase-1)自身剪切活化，活化caspase-1，释放IL-1β、IL-18，引起肝脏炎症反应，并诱导肝细胞凋亡[6-11]。有研究发现β-1,3-葡聚糖作用于支气管上皮细胞后，NLRP3炎症小体活化，且IL-1β分泌增加[12]。本课题组前期在体内实验中已经验证丹皮酚能有效抗ALD[13,14]，但能否对于真菌菌群失调所致β-1,3-葡聚糖介导的ALD发挥作用尚不清楚，本研究拟在体外建立β-1,3-葡聚糖诱导巨噬细胞炎症模型，模拟ALD炎症损伤模型，从分子水平层面来验证丹皮酚通过阻断Dectin-1/NLRP3信号通路来抗ALD炎症损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料与试剂 RW264.7小鼠腹腔巨噬细胞系购于中科院上海细胞库；丹皮酚购自宣城市百草植物工贸有限公司(纯度>99%)；β-1,3-D-葡聚糖、昆布多糖购自美国 Sigma公司；胎牛血清购自上海HAKATA公司；DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司；青霉素-链霉素溶液购自杭州碧云天公司；Trizol试剂购自美国ambion公司； 逆转录试剂盒、SYBR荧光染料购自日本东洋纺公司；抗小鼠β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司； 抗小鼠Dectin-1抗体购自美国Santa Cruz公司；抗小鼠caspase-1抗体、抗小鼠NLRP3抗体和辣根过氧化物酶标记二抗均购自美国Affinity公司；抗小鼠ASC抗体和抗小鼠Syk抗体均购自沈阳万类生物科技有限公司；ECL发光液购自美国Advansta公司；PCR引物采用 Primer 5.0 设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA试剂均购自泉州睿信生物科技有限公司。

1.1.2实验仪器 IX51倒置光学显微镜购自日本 Olympus公司，TDZ4-WS低速水平离心机购自上海卢湘仪有限公司，5430R 4℃离心机购自德国Eppendorf公司，ABI 7500实时荧光定量PCR仪、K3型酶标仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司，PowerPac HC Power Supply 高电流电泳仪购自美国 Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1RAW264.7巨噬细胞培养及药物干预 将冻存在-80℃冰箱的RAW264.7巨噬细胞复苏后，加入含 10%的胎牛血清、100 U/ml青、链霉素的 DMEM 培养基中在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，每天定期观察细胞生长状态，定期更换培养基，当细胞达到对数生长期、融合度到80%以上时，将细胞进行分组，即空白对照组、β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组、昆布多糖组、丹皮酚干预组。根据相关文献以及前期模型和药物筛选结果[15-17]，我们选用70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖造炎症模型，250 μg/ml作为昆布多糖剂量，480 μmol/L作为丹皮酚剂量。空白对照组和β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组用DMEM完全培养基对细胞进行培养24 h，昆布多糖组用昆布多糖(250 μg/ml)对细胞进行干预24 h，丹皮酚干预组用丹皮酚(480 μmol/L)对细胞进行干预24 h，之后弃掉相应的培养基，除空白对照组加入新鲜含血清的DMEM培养基继续培养24 h外，其余组加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖诱导24 h，最后对四组的培养液与细胞进行收集。

1.2.2MTT法检测巨噬细胞的增殖活性 接种3×105ml-1RAW264.7巨噬细胞于96孔板，待24 h完全贴壁后，弃上清，加PBS清洗3遍，空白对照组和β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组加入新鲜DMEM培养基，丹皮酚干预组加入丹皮酚(480 μmol/L)，昆布多糖组加入昆布多糖(250 μg/ml)，分别培养24 h后，弃掉相应的培养基，除空白对照组加入新鲜含血清的DMEM培养基继续培养24 h外，其余组加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖诱导24 h后，避光加入5 mg/ml MTT工作液20 μl，放入二氧化碳培养箱避光培养2 h后，弃上清，加入200 μl DMSO对沉着在孔板底部的棕色甲臜沉淀进行溶解，室温放置摇床低速振荡10 min，酶标仪进行比色，测定490 nm波长下吸光度值。

1.2.3倒置显微镜观察细胞形态 接种3×105个/ml RAW264.7巨噬细胞于6孔板，待24 h完全贴壁后，弃上清，加PBS清洗3遍，空白对照组和β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组用DMEM培养基对细胞进行孵育24 h，Dectin-1抑制剂昆布多糖组用昆布多糖(250 μg/ml)对细胞进行孵育24 h，丹皮酚干预组用丹皮酚(480 μmol/L)对细胞进行孵育24 h，之后弃掉相应的培养基，除空白对照组加入新鲜含血清的DMEM培养基继续培养24 h外，其余组加入70 μg/ml β-1,3-D-葡聚糖诱导24 h，之后弃上清，用PBS清洗3遍后，加入澄清PBS，用倒置显微镜观察各组细胞形态变化。

1.2.4实时荧光定量PCR对巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达的检测 将处理过的细胞用提前预冷的无菌PBS清洗3次后，用细胞刮刀将细胞刮下来并收集到无酶EP管中，根据RNA提取试剂盒的步骤进行RNA提取。之后根据逆转录试剂盒的步骤进行反转录成cDNA。所有引物采用 Primer Premier 5.0 软件设计，委托上海生工生物有限公司合成，各引物序列见表1。RT-qPCR反应体系25 μl：SYBR荧光染料12.5 μl，上游引物(100 μmol/L)1 μl，下游引物(100 μmol/L)1 μl，cDNA 0.5 μl，DEPC水10 μl。在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件：预变性95℃ 1 min；扩增定量程序40个循环，循环参数:变性94℃ 15 s,退火50℃ 15 s,延伸 72℃ 45 s；溶解曲线60～95℃，加热速率0.1℃/s，管家基因为β-actin，实验重复3次。定量分析实时荧光定量PCR分别测定目的基因 Dectin-1、NLRP3、caspase-1及内参β-actin的Ct值，实验结果取其平均值，用2-ΔΔCt来表示基因表达量变化。

1.2.5Western blot检测Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表达 取6孔板细胞置于冰上，每孔加200 μl含PMSF的RIPA裂解液，用干净的刮刀将细胞刮于EP管中，冰上裂解30 min，于4℃下12 000 r/min离心15 min，之后加蛋白上样缓冲液，沸水煮5 min，冷却后，电泳80 V，30 min；120 V，55 min，转膜120 V，1 h 30 min，室温封闭2 h，4℃过夜孵一抗，二抗室温孵育2 h，洗膜，曝光成像，通过Image J 软件分析得出蛋白IOD值，并根据目的蛋白IOD/内参蛋白IOD，计算目的蛋白相对灰度值，进行统计分析。

1.2.6ELISA法检测巨噬细胞培养液中IL-1β和IL-18的含量 根据试剂盒说明书要求，将细胞悬液于3 000 r/min离心10 min去除颗粒和聚合物；设置标准品孔，样本孔，标准品孔加入不同浓度标准品50 μl，待测样品孔里先加入待测样品10 μl再加样品稀释液40 μl；随后每孔加入HRP标记的检测抗体100 μl，封板，37℃温育60 min；弃液体，反复洗涤5次，拍干；每孔加入底物A、B各50 μl，37℃避光温育15 min；每孔加入终止液50 μl，15 min内450 nm波长下测各孔吸光度值。

表1 实时荧光定量PCR 基因引物序列及基因引物长度Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR and length of gene primer

2 结果

2.1丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞增殖活性的影响 如图1,MTT法细胞增殖活性检测结果表明，与空白对照组相比，β-1,3-D-葡聚糖在70 μg/ml浓度能够明显抑制RAW264.7巨噬细胞生长，细胞存活率下降50%，差异具有统计学意义(P<0.001)。与β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组相比， 丹皮酚在480 μmol/L浓度能够明显促进RAW264.7细胞增殖活力，细胞存活率上升，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞增殖活性的影响(n=6)Fig.1 Effect of Paeonol on β-1,3-D-glucan-induced RAW-264.7 macrophages proliferative activity(n=6)Note:Compared with the control group,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan induced model group,##.P<0.01，###.P<0.001.

图2 丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞形态学的影响(n=6,×400)Fig.2 Effect of Paeonol on morphology of RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=6,×400)Note:A,B,C and D were respectively expressed as control group，β-1,3-D-glucan-induced model group，Paeonol 480 μmol/ml group，Laminarin 250 μg/ml group.

2.2丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞形态学的影响 如图2，在400倍倒置显微镜下观察，空白对照组细胞体积偏小，呈现饱满圆润形态；β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组细胞分化严重，细胞体积增大，形态多不规则，有“伪足”伸出，细胞过于狭长，有的甚至呈梭形；丹皮酚干预组细胞分化明显改善，细胞体积变小，“伪足”现象明显减少，细胞大部分恢复至近圆形状态。

2.3丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达的影响 如图3，与空白对照组相比，β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达量明显升高，差异具有统计学意义(P均<0.05)。与β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组相比，丹皮酚干预组Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达量明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

2.4丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达的影响 如图4，与空白对照组相比，β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组Dectin-1、NRP3、caspase-1 mRNA表达量明显升高，差异具有统计学意义(均P<0.05)。与β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组相比，丹皮酚干预组Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达量明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

图3 丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 蛋白表达的影响(n=3)Fig.3 Effects of Paeonol on proteins expression of Dectin-1,Syk,NLRP3,ASC,pro-caspase-1 and caspase-1 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:A,B,C and D were respectively expressed as control group，β-1,3-D-glucan-induced model group，Paeonol 480 μmol/ml group，Laminarin 250 μg/ml group.Compared with the control group,*.P<0.05，**.P<0.01,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01,###.P<0.001.

图4 丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞Dectin-1、NLRP3、caspase-1 mRNA表达的影响(n=3)Fig.4 Effect of Paeonol on mRNA expression of Dectin-1,NLRP3 and caspase-1 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:Compared with the control group,*.P<0.05，**.P<0.01；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01.

2.5丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、IL-18的影响 如图5，与空白对照组相比，β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组细胞分泌的IL-1β、IL-18水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组相比，丹皮酚干预组细胞分泌的IL-1β、IL-18水平明显降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

图5 丹皮酚对β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β、IL-18的影响(n=3)Fig.5 Effect of Paeonol on secretion of IL-1β and IL-18 in RAW264.7 macrophages induced by β-1,3-D-glucan(n=3)Note:Compared with the control group,**.P<0.01,***.P<0.001；compared with the β-1,3-D-glucan-induced model group,#.P<0.05,##.P<0.01，###.P<0.001.

3 讨论

β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，并在真菌过度增殖或死亡时从细胞壁脱落，通过与巨噬细胞表面受体结合诱导炎症因子产生[18-20]。巨噬细胞则是通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)来识别β-1,3-葡聚糖，并分泌炎症因子以促进炎症反应发生[21]。 PRRs分细胞膜外和细胞膜内，膜外以Dectin家族受体研究较多，膜内则以NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)备受关注[22]。其中C型凝集素结构域家族7成员A(CLEC7A；也称为Dectin-1)是C型凝集素受体家族的PRRs，识别真菌细胞壁上暴露的β-1,3-葡聚糖[23,24]。NLRP3 也叫NOD样受体蛋白3，属于炎性复合体的传感蛋白[25]。当细胞受到感染刺激时，被激活的NLRP3形成NLRP3 炎性小体，在炎性小体的作用下，促进下游炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放从而引起炎症反应[26-28]。

新近研究表明，肠道真菌变化与ALD存在密切关联，长期酒精刺激后，肠道真菌菌群紊乱，真菌过度生长，β-葡聚糖作为许多共生真菌细胞壁的主要成分，通过肠屏障，经门静脉转运到肝脏，与肝巨噬细胞上的受体Dectin-1结合，激活NLRP3炎症小体，释放IL-1β和IL-18诱发小鼠ALD炎症损伤[5,29]。

在前期体内实验中，我们通过Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养C57BL/6小鼠建立ALD模型，发现酒精喂养导致肠道真菌失调，真菌丰度增加，血清中β-1,3-D-葡聚糖水平升高，肝脏中Dectin-1/NLRP3信号通路上相关蛋白表达量增多，发生ALD炎症反应。丹皮酚干预后，肠道真菌失调得到改善，血清中β-1,3-D-葡聚糖水平降低，肝脏中Dectin-1/NLRP3信号通路上相关蛋白表达量减少，ALD炎症反应得到缓解。我们推断丹皮酚抗ALD炎症损伤可能与抑制β-1,3-D-葡聚糖介导的Dectin-1/NLRP3信号通路存在相关性。

为了验证丹皮酚是否通过阻断Dectin-1/NLRP3信号通路来预防由β-1,3-D-葡聚糖引起的ALD炎症损伤，我们应用β-1,3-D-葡聚糖诱导RAW264.7巨噬细胞建立体外ALD炎症损伤模型，在β-1,3-D-葡聚糖诱导RAW264.7巨噬细胞24 h后，观察丹皮酚在造模前干预下能否对β-1,3-D-葡聚糖致炎起到预防保护作用，并检测Dectin-1/NLRP3信号通路相关蛋白是否发生改变。我们还应用了Dectin-1阻断剂昆布多糖来验证β-1,3-D-葡聚糖刺激效果。实验研究表明，通过MTT法检测细胞增殖活性与倒置显微镜形态学观察发现β-1,3-D-葡聚糖诱导下的RAW264.7巨噬细胞发生炎症损伤，细胞增殖活力减弱，细胞存活率低下，而丹皮酚干预后能有效缓解并改善RAW264.7巨噬细胞的炎症损伤，提升细胞增殖活力。为了探究丹皮酚抗炎症损伤的作用机制，并依据前期的体内实验，我们从β-1,3-D-葡聚糖结合受体Dectin-1为切入点，进而涉及Dectin-1/NLRP3相关信号通路。经实验证实，β-1,3-D-葡聚糖诱导24 h后的RAW264.7巨噬细胞中存在Dectin-1/NLRP3信号通路激活，相比于空白对照组，β-1,3-D-葡聚糖诱导模型组Dectin-1/NLRP3信号通路相关蛋白诱导Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1以及炎症因子IL-1β、IL-18都明显升高。而丹皮酚干预24 h后可显著降低β-1,3-D-葡聚糖诱导的RAW264.7巨噬细胞中Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1蛋白表达水平和Dectin-1、NLRP3、Caspase-1 mRNA 表达水平，以及细胞分泌的IL-1β、IL-18水平。提示丹皮酚能显著预防β-1,3-D-葡聚糖诱导所致的RAW264.7巨噬细胞炎症反应，从而缓解和改善细胞增殖活力减弱与细胞损伤，推测可能与阻断Dectin-1/NLRP3信号通路的激活有关，以上实验结果与前期体内实验结果一致。通过体内、体外实验验证，我们可以推定丹皮酚是通过抑制β-1,3-D-葡聚糖，阻断Dectin-1与之结合，进而抑制NLRP3炎症小体激活，从而使巨噬细胞分泌IL-1β、IL-18水平降低，缓解ALD炎症损伤。与Xiao等[30]报道的肠道细菌菌群失调导致LPS与TLR4结合，并激活核因子NF-κB诱导的ALD炎症损伤相比，我们的研究是基于肠道真菌菌群及其代谢产物β-1,3-D-葡聚糖在ALD中的显著作用，因此，改善肠道真菌菌群，抑制β-1,3-D-葡聚糖已经成为预防ALD的重要的治疗靶点和潜在手段。

总之,丹皮酚可能通过抑制β-1,3-D-葡聚糖诱导的巨噬细胞Dectin-1/NLRP3信号通路上Dectin-1、Syk、NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1的表达从而有效降低终末炎症因子 IL-1β、IL-18 的释放,进而有效抑制ALD炎症反应。我们的实验数据进一步验证了丹皮酚可以预防ALD炎症损伤，深入探讨了丹皮酚对肠道真菌代谢产物β-1,3-葡聚糖相关的Dectin-1/NLRP3信号通路关键蛋白的调控作用，为将其开发成新型的抗ALD药物提供新的研究思路和重要的实验依据。