MYC/BCL2双表达大B细胞淋巴瘤中PD-L1的表达及其临床意义

王平，杨文秀，周杰，冯江龙，林超群

0 引言

双表达大B细胞淋巴瘤（double-expression large B-cell lymphoma,DEL）临床上以MYC/BCL2双表达最为常见，占弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）的19%～34%[1-2]，已有较多研究证实DEL患者临床预后和治疗效果相对较差，且易发展为复发/难治性大B细胞淋巴瘤[3-6]。染色体9p24.2上CD274基因编码的PD-L1是程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death 1,PD-1）的配体，其相互结合可以介导肿瘤细胞获得免疫逃逸能力[7-8]。研究[9]发现MYC可以结合PD-L1的启动子，促进其表达，从而促进肿瘤的发生发展；具有协同作用的原癌基因MYC、BCL2可能是影响PD-L1蛋白表达的上游基因，三者在淋巴瘤的发病机制中发挥了重要作用[9-11]。本研究收集了一组大B细胞淋巴瘤病例，通过qPCR技术、免疫组织化学双标记和普通免疫组织化学染色法、临床病理资料收集和随访，分析PD-L1表达与DEL的关系及其与患者预后的关系，并探讨PD-L1表达在DEL临床预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 病例收集

收集贵州医科大学附属医院病理科2010年1月1日至2017年12月31日期间确诊的DLBCL病例，将临床病理资料相对完整、肿瘤组织充足的90例病例纳入实验研究。

1.2 主要试剂

PD-L1单抗购于美国Abcam公司，单克隆一抗Pax5、MYC、BCL2和二抗试剂盒（PV-9001、SAP-9102）、EDTA修复液、AP-Red及DAB试剂盒均购自北京中杉公司；RNA提取试剂盒（FFPE RNA）购自厦门艾德公司；SYBR Green荧光染料（TaKaRa RR820A）、反转录试剂盒（TaKaRa RR47A）、内参均购于美国TaKaRa公司；PD-L1引物购于上海生工公司。

1.3 免疫组织化学染色及分组

采用PV二步法检测MYC、BCL2蛋白表达:MYC、BCL2以扁桃体组织为阳性对照；以PBS（pH7.35）代替一抗作阴性对照；以pH（8.0）的EDTA溶液修复抗原；MYC、BCL2稀释比均为1:200；步骤按PV-9001说明进行。

判读标准：MYC阳性信号位于细胞核，BCL2阳性信号位于细胞质。根据文献[12-14]略作修改，随机选择10个不重复的400倍视野，每个视野随机计数400个肿瘤细胞中阳性细胞所占比例，取10个视野的平均值作为该病例表达率。据文献[1-4,12-14]定义MYC≥40%为高表达，BCL2≥70%为高表达。若MYC、BCL2均高表达定义为MYC/BCL2双表达大B细胞淋巴瘤组（简称DEL组），余下归为non-DEL组。

1.4 免疫组织化学双标记染色检测PD-L1表达

根据试剂盒说明Pax5、PD-L1设置阳性对照为扁桃体组织，阴性对照以TBS（pH7.35）替代一抗，并以TBS作为缓冲液及冲洗液；用间接法进行双标记染色，染色步骤简述如下：4 μm厚石蜡切片，脱蜡、水洗、EDTA（pH9.0）进行修复抗原，消除内源性过氧化物酶后血清封闭，先进行Pax5鼠抗人单克隆抗体染色（1:300稀释），按（SAP-9102）试剂盒说明进行Pax5标记（AP-Red显色），再次EDTA（pH8.0）修复后，按Pax5染色的相同步骤进行PD-L1兔抗人单克隆抗体（1:250稀释）标记，DAB显色，透明封片后进行观察和图像分析。

判读方法：Pax5以细胞核出现红色或浅红色颗粒为阳性表达；PD-L1以细胞质或细胞膜形成黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。参照文献[15-16]分析：同MYC、BCL2一样统计肿瘤细胞PD-L1表达率（10个高倍视野平均值），定义肿瘤细胞双标记阳性细胞≥30%（细胞质或膜着黄色、核着红色）为肿瘤细胞PD-L1阳性（PD-L1+）；在PD-L1阴性的病例中，若肿瘤微环境细胞（主要为肿瘤组织浸润T细胞tumorinfiltrating lymphocytes,TILs）PD-L1表达率≥20%，定义为微环境PD-L1阳性[15]，即mPD-L1+。

1.5 RNA提取、反转录、qPCR方法

RNA的提取、检测及反转录：取8 μm组织进行脱蜡、去除二甲苯、蛋白酶消化至清亮后，按RNA提取试剂盒说明进行RNA提取，最后以50 μl的DEPC水溶解RNA，核酸定量仪检测RNA浓度及纯度，取OD值（A260/A280）在1.8到2.0的RNA样本进行实验，按TaKaRa RR47A试剂说明于冰上进行去除基因组DNA（42℃ 2 min），于冰上配置反转录体系后进行反转录（37℃ 30 min，再加热至85℃ 5 s），缓慢冷却后于-80℃冰箱保存。

qPCR：使用两步法检测DEL组与non-DEL组PD-L1的mRNA，据TaKaRa RR820A试剂盒说明，取cDNA样本于冰上配置SYBR Green RT-qPCR反应体系，PD-L1引物：上游：5’-CTATGGTGGTGCCGACTACA-3’，下游：5’-TGCTTGTCCAGATGACTTCG-3’，每个样本设置3个复孔，先配置总反应体系，再分装3个复孔；用β-actin（上游：5’-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3’，下游：5’-TCACCCTTCACCGTTCCAAGTTT-3’）作为内参，于Bio-Rad CFX connect荧光定量PCR仪上进行反应（反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火/延伸为60℃ 30 s，50个循环），以 2-ΔΔCt值为mRNA相对表达量，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt组内最低值。

1.6 随访方法

采取电话或走访方式，以首次确诊时间为开始时间，随访患者首次确诊以后的治疗、健康、复发及生存等情况；每隔3月随访1次（出现死亡或失访时结束该例患者随访），长期存活患者随访截至2018年12月31日。

1.7 统计学方法

用SPSS 17.0软件对数据整理分析；mRNA相对表达量在各组间比较采用t检验，正态分布用（）表示，偏态分布数据经（lg10）转化为正态分布，并用（10lgx±10lgS）表示。计数资料统计采用χ2检验或Fisher精确检验；生存分析采用Kaplan-Meier曲线表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

DLBCL90例，HE染色见图1。男47例，女43例；年龄17～82岁（中位年龄58.5）；根据免疫组织化学染色结果分组，28例为DEL，62例为non-DEL，见图2。据1993年NHL国际预后指数IPI评分：0～2分49例，3～5分41例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期54例，Ⅲ+Ⅳ期36例。

2.2 DEL组与non-DEL组PD-L1蛋白表达情况比较

90例DLBCL肿瘤细胞和微环境中PD-L1阳性分别为22例（24.44%）和26例（28.89%），见图3。DEL组肿瘤细胞和微环境中PD-L1阳性表达率分别为50.00%和32.14%，non-DEL组分别为12.90%和27.42%。肿瘤细胞和微环境PD-L1蛋白表达在DEL组与non-DEL组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

图1 DLBCL的HE染色结果 (HE ×400)Figure 1 Hematoxylin-eosin staining results of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients (HE ×400)

表1 DEL组与non-DEL组PD-L1蛋白表达的比较Table 1 Comparison of PD-L1 protein expression between DEL and non-DEL groups

2.3 DEL组与non-DEL组间PD-L1 mRNA相对表达量比较

qPCR检测结果显示DEL组（0.9862±0.49853）与non-DEL组（0.7175±0.29265）PD-L1 mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（95%CI:0.06325～0.47419,t=2.653,P=0.012）。

2.4 DEL组中PD-L1表达与临床病理特征的关系

图2 DLBCL免疫组织化学染色结果 (PV ×400)Figure 2 Immunohistochemical results of DLBCL (PV ×400)

图3 DLBCL中肿瘤细胞和微环境细胞PD-L1的表达 (PV ×400)Figure 3 PD-L1 expression in tumor cells and microenvironment cells of DLBCL (PV ×400)

DEL组中，25例检查血清乳酸脱氢酶（LDH）其中13例PD-L1+，8例mPD-L1+，4例mPD-L1-；24例检查β2微球蛋白（β2-MG），其中14例PD-L1+，7例mPD-L1+，3例mPD-L1-，IPI评分0～2分组、3～5分组均为14例，Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期分别为15例、13例；PD-L1+与性别、年龄、Ann Arbor分期、LDH、β2-MG无相关性，但与IPI评分和B症状的出现显著相关（P值分别为0.007、0.021）；mPD-L1+与上述临床病理特征均无相关性（均P＞0.05），见表2。

表2 DEL组肿瘤细胞和微环境中PD-L1表达与临床病理特征的关系Table 2 Relation between PD-L1+,mPD-L1+ and clinicopathological characteristics of DEL patients

2.5 DEL患者预后及PD-L1蛋白表达生存分析

DEL组中，生存8例，死亡14例，失访6例，其中复发9例；中位生存时间29月。20例接受R-CHOP治疗，其余不详；Kaplan-Meier生存分析显示PD-L1+组患者总体生存时间（OS）明显短于PD-L1-组（P=0.005），见图4；mPD-L1+组患者OS明显短于mPD-L1-组（P=0.001），见图5。

3 讨论

图4 DEL组中PD-L1+与PD-L1-患者的生存曲线比较(P=0.005)Figure 4 Survival curves of DEL patients with PD-L1+ and PD-L1- (P=0.005)

图5 DEL组中mPD-L1+与mPD-L1-患者的生存曲线比较(P=0.001)Figure 5 Survival curves of DEL patients with mPD-L1+and mPD-L1- (P=0.001)

尽管淋巴瘤的WHO分类还未将DEL单独列出，但这类淋巴瘤和“双打击淋巴瘤”相类似，在临床上具有独特的临床特点。多项研究[1-4,12-14]表明这类共表达淋巴瘤的IPI评分和肿瘤细胞增殖指数高，常有多个结外部位累及，患者在接受标准的R-CHOP免疫化疗方案治疗后复发率高，且5年生存率也较低。因此，发现这类DEL的理想预后评估因素和有效的治疗靶点有着重要意义。

PD-L1表达与T淋巴细胞的凋亡及活化有关，其上调表达通过与浸润T细胞表面受体PD1的结合诱导效应T细胞凋亡、抑制T细胞活化，从而产生肿瘤生长的微环境，介导肿瘤细胞的免疫逃逸[6-7]。PD-L1表达对大B细胞淋巴瘤影响的研究多集中在部位特点和细胞来源特点等方面。Kiyasu研究小组[15]统计1 235例临床样本，发现肿瘤细胞表达PD-L1在DLBCL中阳性率为11%，微环境细胞PD-L1阳性表达率为15.3%，PD-L1及mPD-L1的表达与GCB样DLBCL和EB病毒阳性的大B细胞淋巴瘤病例显著相关，且PD-L1+的患者总生存期（OS）低于PD-L1-的DLBCL患者。Liu等[16]检测92例原发肠道的弥漫大B细胞淋巴瘤样本中PD-L1的表达，结果与Kiyasu研究小组的结果相似，但微环境中PD-L1的阳性率相对较高。本研究发现PD-L1、mPD-L1在90例大B细胞淋巴瘤中的阳性表达率分别为24.44%和28.89%，与Liu 等的研究报道相近。

有研究报道[17]DLBCL患者如果伴有PD-L1的DNA扩增、mRNA上调及蛋白高表达，其生存预后均不理想，且PD-L1蛋白表达并不完全由基因调控，可能还受肿瘤环境中的其他因素影响。Casey 团队[9]发现MYC可以与PD-L1启动子结合，直接调控PD-L1表达，沉默MYC后PD-L1蛋白表达明显下降；Rossille研究结果[18]表明，在BCL2阳性侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中，血清PD-L1高表达水平患者的总体生存期（OS）明显短于血清PD-L1低表达水平患者。本研究发现在MYC/BCL2共表达淋巴瘤中PD-L1、mPD-L1的阳性表达率明显高于非共表达大B细胞淋巴瘤，且在该类淋巴瘤中PD-L1 mRNA相对表达量明显上调。既往报道和我们的结果都提示PD-L1与MYC/BCL2蛋白表达可能存在某种关联，它们之间可能存在一些信号转导通路的“串话”。具体机制有待于进一步深入的分子、基因等方面研究探讨。

本研究统计DEL患者临床相关数据提示在DEL中PD-L1蛋白表达与高IPI评分和B症状的出现有关；此外，通过对28例DEL患者生存随访资料统计分析发现，DEL患者中PD-L1无论在肿瘤细胞表达还是在肿瘤微环境细胞中的表达，患者OS均显著低于阴性组；这些结果都提示，PD-L1蛋白的上调表达与DEL患者不良预后相关。

作为一项回顾性的研究，本实验存在一定的缺陷：首先因受到总样本量收集的限制，纳入研究样本量相对较小，统计结果可能与大样本的研究结果会存在一定误差；其次，本实验部分RNA提取使用的组织为年份较长的石蜡组织，可能提取RNA存在降解，对实验也有一定的影响。因此，还需扩大样本量、使用新鲜离体组织或提高各项检测技术等来验证我们的结果。

综上所述，MYC/BCL2共表达大B细胞淋巴瘤中PD-L1蛋白和mRNA均上调表达，这可能与这类淋巴瘤不良预后有关，它在这类淋巴瘤预后评估中的价值还有待于进一步研究证实。