冻融治疗后肝癌库普弗细胞分泌功能的变化

朱亚玲 ，易峰涛,，丁梦南，曾程，徐振华，邵志雄，谢俊杰

0 引言

在过去20年里，局部肿瘤的冻融治疗已经有了长足的发展，主要集中在肝癌[1]、转移性癌[2]、肾癌[3]、前列腺癌[4]等实体瘤治疗中。同时，越来越多的报道表明，冻融治疗可以破坏肿瘤，增强或诱导细胞免疫或抗肿瘤免疫应答[5-7]。此外，肿瘤细胞的破坏和溶解可能成为炎性反应的重要介质[8]。

库普弗细胞（Kupffer cells,KCs）是数量最大的免疫细胞，占肝脏巨噬细胞的80%～90%，也是单核吞噬细胞系统的重要组成部分，在肝脏巨噬细胞的发生发展中起着重要的作用[9]。KCs的激活与多种细胞因子的分泌密切相关，这些细胞因子参与免疫和促炎或抗炎反应[10]。KCs自身还具有分泌炎性因子的功能，参与肝脏中各种重要的生理和病理过程，如炎性反应、脂质代谢、移植免疫等[11]。

因此，有必要研究冻融后KCs分泌功能的特征，帮助我们治疗肝癌，促进患者的早期康复，为肝癌冻融治疗能提高自身免疫功能的学说提供理论依据。为此，本研究通过体外细胞实验，从兔肝中提取KCs并进行了体外培养，应用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）阻断NFκB信号通路后，观察KCs的分泌功能变化，探索冻融治疗引起KCs功能变化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NF-κB抑制剂PDTC购自美国BioVision公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；低糖DMEM完全培养基购自美国ATCC公司；0.4%锥虫蓝溶液购自美国Sigma公司；GAPDH购自英国Abcam公司；蛋白Marker（10～170 kDa）购自立陶宛Fermentas公司；0.45 μm PVDF膜购自美国Millipore公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒、PMSF（100 mmol/L）、磷酸化蛋白酶抑制剂、5×蛋白上样缓冲液、10×丽春红染液和抗体洗脱液均购自武汉拓捷生物公司；Tris和甘氨酸购自国药集团化学试剂有限公司（上海）；动物麻醉剂（速眠新Ⅱ）购自中国动物保健品有限公司（北京），其他试剂由中国人民解放军中部战区总医院医学实验科提供。

1.2 方法

1.2.1 KCs细胞悬液的制备 经肌肉注射速眠新Ⅱ（0.2 ml/kg）麻醉后，对其进行消毒、开腹、门静脉暴露和固定插管并打开胸腔。根据Zeng等[12]制备KCs细胞悬液的方法，对下腔静脉结扎后，快速切割、断裂部分肝脏，用PBS冲洗两次。取肝悬液离心，取上清液。充分悬浮后，将上述肝细胞悬液移入含30%和60%细胞分离液的离心管中，以800g（20℃）缓升缓降离心20 min，离心后可见乳白色细胞层。收集细胞层，继续培养。

1.2.2 构建低温和冻融坏死的肿瘤细胞攻击KCs的细胞模型 模拟冻融治疗时体内KCs受到的主要攻击因素是低温和冻融坏死物质，构建体外细胞模型。将浓度为1×106/ml的KCs悬浮液用5 ml一次性塑料吸管分为不同的培养瓶，每瓶加入5 ml。实验分为8组，每组9瓶：（1）对照组：KCs正常培养37℃；（2）0℃组：模拟冻融治疗时冰球边缘温度，将培养瓶置于0℃环境中20 min，取出放回37℃孵化器。5 min后，将培养瓶置于0℃环境中20 min，再放入37℃培养箱中，培养6 h后，进行实验；（3）5℃低温组和10℃低温组：模拟冻融治疗时冰球边缘距离0.5 cm和2 cm的温度。实验方法与0℃组相同，但放置培养瓶的温度环境不同。5℃组在5℃环境中放置2次20 min，10℃组在10℃环境中放置2次20 min；（4）冻融坏死物质组：冻融治疗后第3天将治疗中心肿瘤组织（人肝癌HepG2细胞购于中国科学院上海科学院资源中心，于中国人民解放军中部战区总医院医学实验科内进行传代培养）制成1%细胞悬液，在KCs培养瓶中加入2 ml，其余培养条件与对照组相同；（5）联合刺激组：按不同温度（0℃、5℃、10℃）放置的KCs培养瓶分为3组。各组再加入冻融肿瘤坏死细胞悬液，其浓度与冻融坏死物质组相同，实验方法分为0℃、5℃和10℃组。

1.2.3 干预措施 以上8组各设1个平行组。将PDTC加入培养基中，NF-κB抑制剂最终浓度为100 μmol/L。

1.2.4 KCs分泌功能的检测 参考文献中的方法[13]，采用ELISA法检测KCs上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1β）和干扰素-γ（INF-γ）的浓度。各组采用ELISA法检测细胞培养液中的IFN-γ、IL-1β、TNF-α的浓度。

1.2.5 NF-κB蛋白测定 各组培养6 h后，用Western blot法检测各组NF-κB蛋白的表达，用定量软件处理系统分析靶带的吸光度值。Western blot检测方法如文献所述[14]。用鼠抗NF-κB抗体（sc-109，Santa Cruz生物技术，美国圣克鲁斯州）进行印迹检测，计算靶带的吸光度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析。计数资料以均数±标准差（）表示，采用t检验及方差分析；计量资料以率（%）表示，采用χ2检验；组间比较采用单因素方差分析；组内比较采用Friedman检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KCs分泌功能测试

（1）无抑制剂组与对照组比较：低温组（0℃、5℃、10℃）和10℃冻融坏死物质组培养1 h时KCs细胞分泌炎性因子水平差异无统计学意义（P＞0.05），冻融坏死物质组与联合刺激组比较KCs细胞分泌炎性因子水平差异有统计学意义（P＜0.05），10℃冻融坏死物质组与对照组比较KCs细胞分泌炎性因子水平差异有统计学意义（P＜0.05）。各组培养1 h，与对照组比较（P＜0.01），差异有统计学意义。（2）无抑制剂组KCs细胞分泌炎性因子水平与培养时间的相关性：随着培养时间的延长（1、2、3 h），炎性因子的分泌水平显著升高，差异有统计学意义（χ2=10.750,P=0.005）。（3）抑制剂组与对照组比较：各组KCs细胞分泌炎性因子水平比较（P＞0.05），差异无统计学意义；组内KCs细胞分泌炎性因子水平比较，差异无统计学意义（χ2=2.25,P=0.325）。（4）有抑制剂组和无抑制剂组KCs细胞分泌炎性因子水平比较，两组在相同条件下（对照组除外）均有统计学意义（P＜0.01）。

KCs分泌功能结果显示，用低温或冻融坏死物或联合刺激KCs后培养1 h，炎性因子的分泌增加（P＜0.01），低温和冻融坏死产物组的联合刺激具有叠加作用。此外，随着培养时间的延长（1、3、6 h），炎性因子的分泌水平显著升高（χ2=10.750,P=0.005），有级联放大的趋势。在PDTC存在下，8组间炎性因子的分泌水平差异无统计学意义（P=0.325）。延迟培养时间，各组KCs细胞分泌炎性因子水平无变化，见表1～2。

2.2 NF-κB蛋白表达

低温刺激对NF-κB蛋白的表达无显著影响，而对照组与低温组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。联合刺激组和冻融坏死物质组NF-κB蛋白表达明显上调（P＜0.05），差异有统计学意义。而抑制剂组NF-κB蛋白的表达无明显变化，其线型几乎呈直线状，见图1～3。

3 讨论

KCs凭其吞噬和分泌功能，参与了肝脏多种重要的生理和病理过程，如清除坏死细胞和组织碎片，诱导炎性反应、参与脂质代谢、移植免疫等[15-17]。KCs功能受内毒素、脂多糖、坏死组织或细胞、应激等多种因素的影响[10]。活化的KCs能产生多种细胞因子，包括TNF-α、IL-1β和INF-γ等，对靶细胞产生杀伤作用，从而发挥其生物学作用[18]。冻融治疗主要利用温度急剧变化，破坏肿瘤细胞，同时对治疗区周围组织产生低温刺激，诱发机体应激反应。而应激和坏死肿瘤细胞释放的如水解蛋白酶等细胞有害物均可引起KCs的变化[19]。

表1 无抑制剂组的KCs分泌功能测试结果Table 1 Test results of secretion function of Kupffer cells (KCs) without inhibitor

表2 有抑制剂组的KCs分泌功能测试结果Table 2 Test results of secretion function of KCs with inhibitor

图1 无抑制剂时NF-κB蛋白的表达Figure 1 Expression of NF-κB protein in group without inhibitor

图2 有抑制剂时对NF-κB蛋白表达的影响Figure 2 Effect of inhibitor on expression of NF-κB protein

图3 NF-κB蛋白的表达Figure 3 Expression of NF-κB protein

KCs受到低温或冻融坏死物质刺激后，可促进炎性因子的分泌，如TNF-α、IL-1β和INF-γ，这些炎性因子可诱导炎性细胞聚集、介导炎性反应和清除坏死细胞或组织碎片[20]，这一反应过程可能是冻融治疗后残存肿瘤的一个杀伤机制。此外，本研究还发现，在培养瓶中加入NF-κB抑制剂后，低温组、冻融坏死物质组和联合刺激组的炎性细胞因子水平均无变化，说明用NF-κB抑制剂可以抑制炎性因子的分泌过程。同时，还发现TNF-α、IL-1β和INF-γ的浓度与KCs上清液中NF-κB蛋白表达呈正相关，所以冻融治疗后KCs的分泌功能可能通过NF-κB信号通路调控。

NF-κB是一个转录因子家族，调控大量参与细胞存活、炎性反应和免疫反应等重要生理过程的基因。最近有研究表明，NF-κB的组成型表达与多种类型的癌症有关[21]。NF-κB信号通路也是炎性反应相关的癌症发生的重要因素[22]。本研究通过对NF-κB信号通路相关蛋白的检测，探讨了KCs诱导炎性反应的机制。NF-κB是细胞内重要的核转录因子，是细胞免疫和炎性反应的重要组成部分[23]，它参与多种基因的表达和调控[24]。关于KCs活化的信号转导途径，认为NF-κB是调节KCs活化的关键因素[25]，NF-κB在某些细胞信息转录调控中起着关键作用[26]，它是细胞活化的标志，也是激活炎性反应的重要因素[27]。有研究证实，NF-κB信号通路是肿瘤治疗的潜在靶点[28]。如果这一信号通路在冻融治疗引起的免疫功能变化中发挥类似作用，将有助于探讨冻融治疗后免疫功能变化的机制。其最直接的判断方法即阻断NF-κB信号通路。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯在NF-κB活化通道的不同水平发挥抑制NF-κB蛋白表达的作用，从而阻断NF-κB信号通路，阻断是否成功可以通过检测NF-κB信号通路中的通路终末蛋白NF-κB蛋白的表达情况判断。

在KCs培养瓶中加入冻融坏死物质，其中含有细胞毒素等刺激信号，这些信号可与KCs膜表面受体结合，如与清道夫受体（scavenger receptor,SR）结合，被吞噬到KCs内；再经过多级级联反应，使NF-κB的抑制蛋白（IKB）的上游激酶IKB激酶（IKB kinse,IKK）磷酸化而激活，IKK使IKB降解。P50有核定位信号，当失去了IKB的束缚后，P50会携载RelA（P65）向核内迁移，P65与细胞核内基因启动子或增强子区域上的顺势反应元件结合，从而调控靶基因的转录，诱导NF-κB mRNA的产生，最后转录、产生和释放各种细胞因子（如TNF-α、IL-1β等）[29]。本研究检测结果提示加入冻融坏死物质后，NF-κB蛋白表达上调，炎性因子分泌增加，说明NF-κB信号通路的存在；而加入PDTC后，PDTC作为一种抗氧化剂，可以在NF-κB活化通道的不同水平发挥抑制NF-κB蛋白表达的作用，如阻止上游IKK磷酸化，从而阻止NF-κB信号通路，抑制NF-κB蛋白表达，导致炎性因子分泌减少。反向证明冻融治疗后KCs的变化可能通过NF-κB信号通路发挥作用。

综上所述，冻融治疗可以改变KCs周围的微环境，刺激KCs分泌细胞因子的功能，从而诱导炎性反应，清除肿瘤细胞。另外还证实KCs分泌功能变化可能是通过NF-κB信号通路转导的。