不同时机针刺对卵巢早衰模型大鼠中枢及外周激素水平的影响

陈滢如,董峰,李春华,陈虹,肖涛

·动物实验·

不同时机针刺对卵巢早衰模型大鼠中枢及外周激素水平的影响

陈滢如1,董峰1,李春华2,陈虹3,肖涛1

(1.中国中医科学院针灸研究所,北京 100700;2.首都医科大学电力教学医院,北京 100073;3.陕西中医药大学第二附属医院,咸阳 712000)

探讨不同时机针刺对卵巢早衰模型大鼠中枢及外周激素水平的影响。50 只清洁级性成熟未交配雌性SD大鼠,随机分为模型组(10只)、预针刺组(10只)、针刺组(10只)、佐剂组(5只)、空白组(5只)。模型组、针刺组及预针刺组连续15 d腹腔注射去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide, VCD)160 mg/kg建立卵巢早衰动物模型;佐剂组连续15 d注射同等剂量佐剂二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO);预针刺组在开始造模时即开始针刺,造模成功后继续治疗4周;针刺组于造模成功后开始针刺治疗,连续治疗4周;空白组不干预。治疗结束后,采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测各组下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin release hormone, GnRH)、垂体促卵泡生成素(follicle stimulatin hormone, FSH)、垂体促黄体生成素(luteotropic hormone, LH),卵巢中促卵泡生成素受体(follicle stimulatin hormone receptor, FSHr)、促黄体生成素受体(luteotropic hormone receptor, LHr)、雌激素受体(estradiol receptor, Er)、雌二醇(estradiol, E2),血清中GnRH、FSH、LH和E2水平。VCD腹腔注射可以造成大鼠卵巢早衰的动物模型,成功率为83.3%。与空白组比较,模型组大鼠下丘脑GnRH含量升高(＜0.05),垂体FSH和LH含量均升高(＜0.05);血清中 GnRH、FSH、LH含量均升高(＜0.05),E2含量降低(＜0.05);卵巢组织中FSHr、LHr含量均升高(＜0.05),Er和E2含量均降低(＜0.05)。与模型组比较,预针刺组和针刺组大鼠下丘脑GnRH含量降低(＜0.05),垂体FSH含量降低(＜0.05);预针刺组和针刺组大鼠血清中GnRH、FSH含量均降低(＜0.05);预针刺组和针刺组大鼠卵巢组织中FSHr、LHr含量均降低(＜0.05),E2含量升高(＜0.05)。 预针刺组和针刺组各项指标组间比较差异均无统计学意义(＞0.05)。针刺对POF模型大鼠中枢及外周激素水平均可产生一定的调节作用,不同时机针刺组间比较无差异。

针刺疗法;卵巢早衰模型;大鼠;促性腺激素释放激素;促卵泡生成素;促黄体生成素;促黄体生成素受体;雌激素受体;雌二醇

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指女性在40岁以前发生的自然绝经[1],伴随不孕、更年期综合征等一系列健康问题[2]。实验室检查表现为雌激素(estradiol, E2)水平下降、促性腺激素升高(促卵泡生成素,follicle stimulatin hormone, FSH)升高,其发病与遗传、放化疗、卵巢手术史、自身免疫功能异常、化学物质及不良生活方式等相关[3-6]。

研究认为下丘脑-垂体-卵巢-颗粒细胞通路在POF发病中具有重要作用,下丘脑合成的促性腺激素释放素(gonadotropin release hormone, GnRH)调控促性腺激素(FSH/LH)的合成与分泌;促性腺激素(FSH/LH)到达卵巢后,调节卵泡的生长、发育、成熟以及排卵[7-9]。前期临床观察发现针刺有助于降低POF患者血清FSH、LH水平,升高血清E2水平,并可缓解患者精神压力,改善围绝经期症状[10-11]。而针刺治疗本病的机制研究报道尚不多,因此,有必要进行相关的基础研究,探讨针刺治疗POF的可能作用机制,为临床推广针灸治疗提供实验基础。本研究通过腹腔注射氧乙烯基环己烯建立POF大鼠动物模型,观察不同时机针刺对模型大鼠中枢及外周激素水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

性成熟未交配雌性SD大鼠40只,清洁级,体质量210～220 g,周龄8周。在安静环境下分笼饲养于屏障环境实验动物室。实验大鼠由中国食品药品检定研究院提供,动物许可证号SCXK(京)2014-0013。

1.2 主要试剂与仪器

去氧乙烯基环己烯(CAS 106-87-6,上海麦克林生化科技有限公司),二甲基亚砜(CAS 67-68-5,上海麦克林生化科技有限公司),ELISA试剂盒,GnRH(CSB- E08037R),FSH(CSB-E06869R),LH(CSB-E12654R),FSHr(CSB-E09673R),LHr(CSB-139832R),Er(CSB-06848R),E2(CSB-E05110R)武汉华美生物工程有限公司,瑞氏-姬姆萨染色套组(G1007,武汉谷歌生物科技有限公司)。全波长扫描式多功能酶标仪(型号Thermo VARIOSKAN FLASH,美国Thermo公司),离心机(型号 Eppendonf 5430R,德国Sigma公司),生化培养箱(型号LRH-70中国上海一恒科技有限公司),制冰机(型号XB70-FZ,中国宁波格兰特制冷设备制造有限公司),水纯化系统(型号Milli-Q Integral,法国Merck Milipore公司)。

1.3 模型选择

目前较为常见的POF动物模型有化疗药物模型、自身免疫性疾病模型、半乳糖血症模型、基因敲除模型、环境化学物质模型等,每种动物模型都侧重于不同的病因学,有着各自的独特性和局限性[12]。本研究所采用的模型,即环境化学物质VCD模型,是近几年逐渐被关注的一种模型,在国内的应用尚不广泛。该造模方法能选择性破坏雌鼠和灵长类动物的原始卵泡和初级卵泡,对次级卵泡和窦卵泡无影响[13],其所造成的因卵泡耗竭而致的卵巢早衰与生理性卵巢功能衰退表现类似;该大鼠模型成功地复制了人类绝经前期及绝经后期的状态,且对性腺以外的器官几乎无影响[14],与临床中POF患者多为特发性[15]的特点吻合。课题组前期临床研究所纳入的POF患者均是特发性(50%的发病病例无明确的病因,被称为特发性或原发性POF),为了使本次研究选择的POF模型大鼠更好地模拟临床,故选择VCD模型。

1.4 动物分组与模型制备

根据体质量随机分为空白对照组(5只)、佐剂组(5只)、模型组(10只)、预针刺组(10只)、针刺组(10只)。空白对照组大鼠只进行抓取,不施加其他干预措施;佐剂组大鼠每天注射同等剂量DMSO 5 mL/kg,连续腹腔注射15 d;模型组、预针刺组、针刺组进行POF模型制备。

模型制备:将VCD溶于佐剂DMSO中,配成32 mg/mL的浓度,以5 mL/kg(即160 mg/kg)的剂量腹腔注射,连续注射15 d。VCD腹腔注射结束后,连续5 d对雌性SD大鼠进行阴道分泌液采样涂片。经瑞氏染色后光镜下观察脱落细胞(见图1)。动情前期为大量不规则形有核上皮细胞,偶见少量角化上皮细胞;动情期见大量不规则形角化上皮细胞,多成堆积状互联成片;动情后期见不规则角化上皮细胞、有核上皮细胞和白细胞;动情间期见大量白细胞、少量有核上皮细胞,偶见角化上皮细胞。镜下连续5 d呈现无规律动情周期变化则可确定为POF大鼠模型建立。经筛查共计造模成功大鼠25只。

阴道涂片操作:左手食指和中指压住大鼠颈部,掌根部压于腰背部限制活动,右手翻起尾巴露出阴道口,将鼠尾交与左手拇指与食指固定,右手用沾有生理盐水的棉签在阴道口稍作停留以让雌鼠适应,稍后轻轻插入大鼠阴道壁缓慢转动半圈,抽出棉签并将棉签上的附着物均匀涂在载玻片上镜检。

瑞氏-姬姆萨染色操作:①滴加瑞氏-姬姆萨A溶液于涂片上,并让染液覆盖整个标本涂片染色0.5 min;②再将瑞氏-姬姆萨B溶液滴加于A液上面(滴加量为A液的2～3倍),以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状,使两液充分混合,染色2～5 min;③水洗、干燥、封片、镜检。

图1 阴道脱落细胞(×200)

1.5 干预方法

模型组,每天腹腔注射VCD 5 mL/kg,连续注射15 d;佐剂组,每天注射同等剂量DMSO 5 mL/kg,连续注射15 d。预针刺组与针刺组给予针刺干预;预针刺组,自开始造模即同步开始针刺治疗,连续治疗6周(治疗结束时间同针刺组);针刺组,于造模成功后开始针刺,连续治疗4周;在针刺组开始进行治疗时,空白对照组、模型组、佐剂组只进行抓取,不进行任何治疗。

针刺方法:应用华佗牌一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm,0.20 mm×13 mm),按全国协编教材《实验针灸学》大鼠标准穴位图谱定位。穴位分两组,关元、足三里(双)、三阴交(双);百会、次髎(双),各穴位直刺或平刺3～5 mm。两组穴位交替使用。同侧足三里、三阴交为一组,采用双侧两组电针,次髎穴采用电针,选连续波,强度0.1～0.3 mA,治疗频次为每周3次,疗程为4周。

1.6 指标检测

实验大鼠经戊巴比妥钠麻醉,经腹主动脉取血,分别取双侧卵巢、下丘脑、垂体。

1.6.1 血清GnRH、FSH、LH、E2含量检测

实验大鼠戊巴比妥麻醉,经腹主动脉取血4℃静置30 min后,低温3000 r/min离心取上清低温保存。血清室温解冻后,1000 r/min离心15 min,①将所需试剂室温平衡至少30 min;②取出酶标板,设立空白孔(不加任何液体)、标准品孔和样本孔,每孔上样50mL;③每孔加入酶结合物50mL,再按同样顺序加入抗体50mL,充分混匀,贴上不干胶封片,37℃孵育1 h;④手工洗板,重复3次;⑤每孔加显色剂A液50mL,显色剂B液50mL,振荡混匀后,37℃避光显色15 min,每孔加终止液50mL;⑥在反应终止10 min内用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔光密度(OD值);⑦按标准品及OD值绘制标准曲线,获得直线回归方程式,计算出样本实际浓度。

1.6.2 组织GnRH、FSH、LH、FSHr、LHr、Er、E2含量检测

实验大鼠戊巴比妥麻醉,经腹主动脉取血后,依次取大鼠垂体、下丘脑、双侧卵巢,经液氮迅速降温后移至低温冰箱保存。①组织块称重(50～500 mg),用镊子移入玻璃匀浆管中;②用移液枪量取预冷的0.86%生理盐水于玻璃匀浆管中(在冰水浴中进行操作),生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍;③左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6～8 min),充分研碎,使组织匀浆化;④将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机4000 r/min离心15 min;⑤取上清。组织上清中激素含量的ELISA检测步骤同上。

1.7 统计学方法

数据采用SPSS19.0统计分析软件进行处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。数据正态性分布采用-(检验),多组间均数的比较采用单因素方差分析,组间均数两两比较,方差齐时采用法,方差不齐时采用’3法。a=0.05。

2 结果

2.1 模型评价

给予VCD腹腔注射的30只大鼠动情周期均出现不同程度的紊乱,多表现为动情间期,其中有25只大鼠在连续给药后出现无规律动情周期变化,其中模型组9只、预针刺组8只、针刺组8只,有5只大鼠仍可观察到类似规律动情周期的变化,造模成功率为83.3%。在实验过程中模型组和针刺组各有1只大鼠死亡。

2.2 各组大鼠下丘脑、垂体激素水平变化

各组数据-(检验)均＞0.05,为正态分布,各数据方差齐性检验()均＞0.05,方差齐。

由表1可知,与空白组比较,模型组大鼠下丘脑GnRH含量升高(＜0.05),垂体FSH和LH含量均升高(＜0.05);佐剂组下丘脑GnRH含量、垂体FSH和LH含量均无明显变化(＞0.05)。与模型组比较,预针刺组和针刺组大鼠下丘脑GnRH含量降低(＜0.05),垂体FSH含量降低(＜0.05),垂体LH含量有下降但无明显差异(＞0.05)。与预针刺组比较,针刺组大鼠下丘脑GnRH含量、垂体FSH和LH含量均无明显差异(＞0.05)。

表1 各组大鼠下丘脑、垂体激素水平比较 (±s)

注:与空白组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05

2.3 各组大鼠血清中激素水平变化

各组数据-(检验)均＞0.05,为正态分布,各数据方差齐性检验()均＞0.05,方差齐。

由表2可知,与空白组比较,模型组大鼠血清中GnRH、FSH、LH含量均升高(＜0.05),E2含量降低(＜0.05);佐剂组大鼠血清中GnRH、FSH、LH含量均无明显变化(＞0.05)。与模型组比较,预针刺组和针刺组大鼠血清中GnRH、FSH含量均降低(＜0.05)。与预针刺组比较,针刺组大鼠血清中GnRH、FSH、LH、E2含量均无明显变化(＞0.05)。

表2 各组大鼠血清中GnRH、FSH、LH、E2含量比较 (±s)

注:与空白组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05

2.4 各组大鼠卵巢组织中激素水平变化

各组数据-(检验)均＞0.05,为正态分布,各数据方差齐性检验()均＞0.05,方差齐。

由表3可知,与空白组比较,模型组大鼠卵巢组织中FSHr含量和LHr含量均升高(＜0.05),Er含量和E2含量均降低(＜0.05);佐剂组大鼠卵巢组织中GnRH、LHr、Er含量和E2含量均无明显变化(＞0.05)。与模型组比较,预针刺组和针刺组大鼠卵巢组织中FSHr含量和LHr含量均降低(＜0.05),E2含量升高(＜0.05)。与预针刺组比较,针刺组大鼠卵巢组织中FSHr、LHr、FSHr、LHr含量均无明显变化(＞0.05)。

表3 各组大鼠卵巢组织中FSHr、LHr、Er、E2含量比较 (±s)

注:与空白组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05

3 讨论

卵巢早衰是典型的异质性疾病,病因复杂,机制尚且不明,造模方法多样,每种动物模型都侧重于不同的病因学。本研究所采用的环境化学物质VCD模型是近几年逐渐被关注的一种模型,造模物质VCD是4-乙烯基环己烯的主要代谢产物,制造杀虫剂、橡胶等副产品。该造模方法能选择性破坏雌鼠和灵长类动物的原始卵泡和初级卵泡,对次级卵泡和窦卵泡无影响,成功地复制了人类绝经前期及绝经后期的状态。本研究采用VCD腹腔注射可以造成大鼠卵巢早衰的动物模型,成功率为83.3%,说明该方法能够建立POF大鼠模型。

POF在历代中医典籍中无记载,但根据其症状可统归属于“闭经”“血枯”“年未老经先断”等范畴,肾精虚损、冲任失调、肝血不足是该病的基本病机,情志不遂、精神压抑、暗耗气血是主要诱因。本研究选用百会、关元、足三里、三阴交、次髎穴,肝肾同源,肝藏血调情志,主升发疏泄,取穴百会以益髓充脑调神;任脉为妊养之本,冲脉为血海,冲脉起于关元,关元深部即为胞宫所在,是治疗妇科疾病的要穴,取穴关元有培元固本、调理冲任、补肾益精之功;足三里、三阴交穴健运脾胃,补益气血,肝脾肾三脏同调;次髎穴为妇科疾病常用要穴,从现代解剖学角度看该穴与盆腔受相同神经节段支配,故取该穴以促进局部气血运行,改善盆腔功能状态。本研究发现,采用该穴位组合,两个针刺治疗组中POF模型大鼠的激素水平在治疗后均有着显著变化,而两个针刺治疗组之间无显著差异。

下丘脑-垂体-卵巢轴对维持女性正常生殖功能具有重要作用。下丘脑中促性腺激素释放素促进垂体中促性腺激素FSH和LH分泌,二者到达卵巢后诱导颗粒细胞合成及分泌雌孕激素,调节卵泡的生长、发育、成熟以及排卵;雌激素水平的升高对垂体FSH的分泌起负反馈作用,中枢与外周之间形成有效的反馈与负反馈,使女性机体的性激素水平维持在动态平衡状态。临床中发生POF患者,以促性腺激素FSH、LH水平升高和E2水平下降为特点,打破了中枢与外周之间原有的反馈与负反馈机制。本研究发现,针刺治疗可显著降低POF模型大鼠下丘脑GnRH含量及垂体FSH含量,提示针刺可调节下丘脑、垂体的激素分泌水平,通过中枢层面对POF的高促性腺激素水平产生调节作用;同时,针刺可显著降低POF模型大鼠血清中GnRH和FSH含量,即在针刺干预下,POF模型大鼠外周血清激素表现出与中枢一致的变化趋势,提示针刺通过降低POF模型大鼠血清中GnRH和FSH水平,改善了POF高促性腺激素水平状态对卵巢功能的抑制和影响;到达卵巢的促性腺激素FSH、LH通过与相应受体结合进而发挥作用,本研究发现,通过针刺干预,POF模型大鼠卵巢组织中FSHr含量和LHr含量均显著降低,E2含量显著升高, FSHr和LHr水平的下降有助于缓解高FSH和LH水平对卵巢功能的抑制,E2含量的升高对改善卵巢-中枢的负反馈具有促进作用,进而对改善POF模型大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴的失衡状态产生积极影响。

鉴于前期临床观察认为早期针刺干预对患者卵巢功能的改善更为显著的推论,本研究在针刺时点上采用不同时间干预设计,分别是与造模同步干预、造模成功后干预,从造模来看,预针刺组、针刺组在POF模型制备所需时间上并无差异;在后期针刺治疗影响激素水平的结果来看两组间亦无差异;即通过本次研究尚未发现早期针刺干预的优势。

综上所述,针刺治疗能够降低POF模型大鼠中枢促性腺激素水平,降低外周促性腺激素水平及其受体含量,增加E2水平;提示针刺对POF模型大鼠中枢及外周激素水平均可产生一定的调节作用,不同时机针刺组间比较无差异。

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Effect of Acupuncture at Different Times on Central and Peripheral Hormone Levels in a Rat Model of Premature Ovarian Failure

-1,1,-2,3,1.

1.,100700,; 2.,100073,; 3.S,712000,

To investigate the effect of acupuncture at different times on central and peripheral hormone levels in a rat model of premature ovarian failure.Fifty clean-grade sexually mature non-mating female SD rats were randomized to model (10 rats), pre-acupuncture (10 rats), acupuncture (10 rats), adjuvant (5 rats) and blank (5 rats) groups. An animal model of premature ovarian failure was made by intraperitoneal injection of 4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) 160 mg/kg for 15 consecutive days in the model, acupuncture and pre-acupuncture groups. The adjuvant group was injected with the same dose of Dimethyl sulfoxide (DMSO) for 15 consecutive days. The pre-acupuncture group received acupuncture before model making and four consecutive weeks of treatment after successful model making. The acupuncture group received four consecutive weeks of acupuncture treatment after successful model making. The blank group was not given intervention. Hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH), pituitary follicle stimulating hormone (FSH) and luteotropic hormone (LH), ovarian follicle stimulating hormone receptor (FSHr), luteotropic hormone receptor (LHr), estradiol receptor (Er) and estradiol (E2), and serum GnRH, FSH, LH and E2 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in every group after the completion of treatment.Intraperitoneal injection of VCD could make a rat model of premature ovarian failure with a successful rate of 83.3%. Compared with the blank group, hypothalamic GnRH content increased (＜0.05), pituitary FSH and LH contents increased (＜0.05), serum GnRH, FSH and LH contents increased (＜0.05), serum E2 content decreased (＜0.05), ovarian LHr and Er contents increased (＜0.05) and ovarian E2 and Er contents decreased (＜0.05) in the model group of rats. Compared with the model group, hypothalamic GnRH content decreased (＜0.05), pituitary FSH content decreased (＜0.05), serum GnRH and FSH contents decreased (＜0.05), ovarian LHr and Er contents decreased (＜0.05) and ovarian E2 content increased (＜0.05) in the pre-acupuncture and acupuncture groups of rats. There were no statistically significant differences in various indicators between the pre-acupuncture and acupuncture groups (＞0.05).Acupuncture can produce a certain regulating effect on central and peripheral hormone levels in a rat model of POF. There is no difference between the groups of acupuncture at different times.

Acupuncture therapy; Model of premature ovarian failure; Rats; Gonadotropin release hormone (GnRH); Follicle stimulatin hormone (FSH); Luteotropic hormone (LH); Luteotropic hormone receptor (LHr); Estradiol receptor (Er); Estradiol (E2)

北京市自然科学基金项目(7174324)

陈滢如(1981—),女,主治医师,博士,Email:tcmacu@163.com

2019-05-25

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2020.02.0220

1005-0957(2020)02-0220-06