硫酸化修饰对霍山石斛多糖非酶糖基化活性的影响

2020-02-24史甜甜李强明潘利华罗建平查学强

合肥工业大学学报（自然科学版） 2020年1期

史甜甜, 李强明, 潘利华, 罗建平, 查学强

(合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥 230601)

霍山石斛(Dendrobiumhuoshanense)俗称米斛,是兰科石斛属多年生的草本植物,具有较高的营养和保健价值。前期的研究发现,多糖是霍山石斛的主要活性成分之一,具有抗肿瘤[1]、抗氧化[2]、降血糖[3]等作用。化学结构是多糖药效发挥的基础,研究表明应用化学修饰技术,对多糖的化学结构进行改造,能够明显提高多糖的生物活性[4]。当前,常见的多糖结构修饰方法有硫酸化、磷酸化、乙酰化、烷基化、羟丙基化等,而硫酸化修饰是近年来对多糖结构修饰的代表性方法之一,能大幅提高多糖的生物活性[5-8]。

在非酶促条件下,蛋白质与羰基化合物经过缩合、环化、异构化重排形成稳定的酮胺化合物,即Amadori 产物。该产物再经过氧化、降解、脱水以及重排产生醛类、二羰基化合物等中间产物。这些中间产物可以继续与氨基缩合,最终形成一系列复杂的、稳定的糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)[9],这一过程被称为蛋白质的非酶糖基化反应。糖基化终产物AGEs可以与机体中的蛋白质发生交联反应,从而引发一系列疾病,如糖尿病、心血管疾病等。因此,通过对蛋白质非酶糖基化反应进行干预,将有助于预防和治疗与此相关的疾病。

本文将在课题组前期研究的基础上,采用定位硫酸化的方法对霍山石斛多糖(Dendrobiumhuoshanensepolysaccharide, DHP)进行结构修饰,以期增强霍山石斛多糖对蛋白质非酶糖基化反应的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霍山石斛采自安徽省霍山县大别山区。氨基胍、牛血清白蛋白、叠氮钠购于Sigma公司,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)购于Biosharp公司。其他试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

MCO-17AIC型恒温培养箱(日本三洋电机株式会社);V-1100型可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);1260 Infinity Series型高效液相色谱仪(Agilent公司);PE Paragon 1000 FT型红外波谱分析仪(Perkin-Elmer公司)。

1.3 实验方法

霍山石斛类原球茎的诱导与繁育。将霍山石斛苗茎段接种于MS基本培养基中,(25±2) ℃下诱导原球茎。40 d后将生长良好的原球茎从茎段外植体上分离下来于无激素固体MS基本培养基中继代培养,30 d为一个培养周期,连续继代培养6～10代,取生长良好的培养物为实验材料[10]。

霍山石斛多糖DHP的提取分离纯化。按本课题组的方法[11]提取、分离和纯化DHP。准确称取一定质量的霍山石斛原球茎,粉碎后加入一定体积蒸馏水,水提、醇沉并用Sevage法[12]除去蛋白质,得到总多糖。再经DEAE-Celluose柱分离,收集得到的多糖用2 000 Da透析袋透析后再用8 000～14 000 Da透析袋透析得到袋内大分子多糖即为DHP。

定位硫酸化DHP的制备。准确称量100 mg DHP、500 mg 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯甲烷(DMT-Cl)、10 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于三口烧瓶中,缓慢加入10 mL 甲酰胺(FA),75 ℃条件下搅拌7 h后将温度降至0 ℃,逐滴加入0.5 mL三氟乙酸酐搅拌3 h后于室温条件下搅拌1 h。将反应溶液加入到无水乙醇中,并反复用氯仿和无水乙醇洗涤得到中间产物。加入80%乙酸溶液室温搅拌2 h,随后加入无水乙醇,静置过夜,离心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀。将醇沉得到的产物按照文献[13]方法进行硫酸酯化反应,反应结束后调节pH值至7.0,加入无水乙醇,静置过夜,离心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀。将所得产物溶于蒸馏水,于60 ℃搅拌4 h,透析,冷冻干燥得到6-O-硫酸化霍山石斛多糖衍生物(6-O sulfatedDendrobiumhuoshanensepolysaccharide derivatives,6-O-SDHPD)。

称量100 mg DHP、500 mg 4,4′-二甲氧基三苯甲基氯甲烷(DMT-Cl)、10 mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)置于三口烧瓶中,缓慢加入10 mL 甲酰胺(FA),75 ℃条件下搅拌7 h后加入酯化试剂。反应结束后调节pH值为7.0,并加入无水乙醇醇沉。将醇沉物溶于80%的乙酸溶液,室温搅拌2 h,再加入无水乙醇醇沉,离心(10 000 r/min,10 min)得到沉淀,溶于蒸馏水,透析后冷冻干燥得到2,2′,4-O-硫酸化霍山石斛多糖衍生物(2,2′,4-O sulfatedDendrobiumhuoshanensepolysaccharide derivatives,2,2′,4-O-SDHPD)。

多糖的分子量测定。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定多糖分子量[14]。本实验所用色谱条件为:色谱柱为TSK G5000PWxl(7.8×300 mm)和TSK G54000PWxl(7.8×300 mm)串联,检测器为示差折光检测器,流动相为超纯水,柱温为30 ℃,流速为0.5 mL/min,进样量为20 μL。

硫酸根取代度测定。硫酸化多糖中硫酸根取代度测定采用氯化钡明胶法[15],其计算公式如下:

(1)

其中,w为硫元素的质量分数。

碳水化合物质量分数测定。硫酸化多糖的碳水化合物质量分数测定用苯酚硫酸法[16]。

红外光谱分析。称取2 mg 干燥的6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD样品,与KBr充分混合研磨、压片后进行傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared,FTIR)扫描(4 000～400 cm-1)。

抗蛋白质非酶糖基化反应体系建立。在超净工作台中,向细胞培养瓶中分别加入5 mL牛血清白蛋白溶液(20 mg/mL)和葡萄糖溶液(500 mmol/L),即为完整的蛋白质非酶糖基化反应体系。用200 mmol/L pH值为 7.4的巴比妥钠缓冲液溶解一定质量多糖定位硫酸化衍生物,过滤除菌后,加入到完整的蛋白质非酶糖基化反应体系,使其终质量浓度分别为1、0.1 mg/mL;同样,以巴比妥钠缓冲液溶解一定质量氨基胍作为阳性对照,除菌后加入到完整的蛋白质非酶糖基化反应体系中,使其终质量浓度分别为1、0.1 mg/mL。所有反应物在37 ℃恒温培养箱中培养后进行下述实验。连续培养28 d,每隔7 d测定1次。

Amadori产物测定。准确吸取0.5 mL培养液于2.0 mL含 0.3 mmol/L NBT的碳酸钠缓冲溶液(100 mmol/L, pH值为10.35)中,混合均匀,在室温条件下孵化15 min。在530 nm处测定吸光值,并对非酶糖基化抑制率IR进行计算,以碳酸钠缓冲液为空白对照,具体计算公式如下:

(2)

其中,A空白为空白组的吸光值;A药物为治疗组的吸光值。

二羰基化合物测定。准确吸取0.4 mL培养液于0.2 mL 500 mmol/L吉拉德-T储备液和3.4 mL 500 mmol/L的甲酸钠溶液(pH值为2.9)中,混合均匀,于室温下孵育1 h。在294 nm处测定吸光值,并按(2)式对非酶糖基化抑制率IR进行计算。以甲酸钠溶液为空白对照。

糖基化终产物荧光强度的测定。准确吸取0.1 mL培养液,稀释至3 mL,在激发波长为370 nm、发射波长为440 nm处测定样品的荧光值F,并对非酶糖基化的抑制率IR进行计算,具体计算公式如下：

(3)

其中,F空白为空白组的荧光值;F药物为治疗组的荧光值。

1.4 数据分析

所有实验均重复3次,数据取(平均值±标准差),采用SPASS数据处理软件对实验数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 常规指标分析

6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的分子量、取代度和碳水化合物的质量分数见表1所列, 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的分子量相近,分别为7.59×106、6.49×106Da;碳水化合物质量分数分别为45.43%、51.17%;6-O-SDHPD的硫酸基取代度为0.813,高于2,2′,4-O-SDHPD的硫酸基取代度,表明6位伯羟基较活泼容易被硫酸根取代。

表1 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的常规指标测定

2.2 多糖的FTIR分析

傅里叶红外光谱是检测官能团的重要手段,6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的FTIR谱图如图1所示。

图1 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的FTIR谱图

从图1可以看出,这2种硫酸化衍生物均具有典型的多糖特征吸收峰。3 398 cm-1附近有一个很强的—OH伸缩振动,2 932 cm-1处的吸收峰对应于C—H的伸缩振动。1 640 cm-1的强吸收峰是—COOR或—CHO中的C=O键的伸缩振动,1 416～1 250 cm-1附近处的吸收峰是由C—O伸缩振动引起的。1 250 cm-1附近有一个强的吸收峰是由不对称的S=O键伸缩振动引起的。830 cm-1左右处有一个对称的C—O—S拉伸振动引起的吸收峰。588 cm-1附近处是由O—S—O的不对称引起的变形。

同时对比保护仲、伯羟基的红外谱图发现在1 716 cm-1和1 180 cm-1处的吸收峰是仲羟基保护基团的O-三氟乙酰基的特征吸收峰,1 360 cm-1和1 154 cm-1附近出现了甲氧基中的甲基和氧的吸收峰。这些结果表明,DHPD实现了定位硫酸化修饰。

2.3 硫酸化多糖对Amadori产物形成的影响

Amadori 作为糖基化反应的早期产物,能与 NBT 在碱性条件下发生颜色反应,在530 nm 处有最大吸收。随着培养时间的延长,硫酸化衍生物对该过程的干预作用如图2所示。

图2 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD对Amadori产物的影响

在0～7 d内,抑制率大幅度增加,说明6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD对Amadori产物的形成起到了抑制作用。随着培养时间的增长,抑制率不断增强,在第21天达到最大值,其中,6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的抑制率分别达到了87.84%、84.93%。由此可以看出,2种硫酸化多糖能明显抑制糖基化早期Amadori产物的形成。

2.4 硫酸化多糖对二羰基化合物形成的影响

糖基化中期,Amadori产物经氧化、水解降解成乙二醛、甲基乙二醛和脱氧葡萄糖醛酮等二羰基化合物。这些中间产物能够与吉拉德-T试剂作用,生成的腙类化合物在294 nm 处有最大吸收。6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD对二羰基化合物形成的影响如图3所示。

由图3可知,随着培养时间的延长,6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD对二羰基化合物形成的抑制作用不断增强,培养28 d后,高剂量的6-O-SDHPD与2,2′,4-O-SDHPD对二羰基化合物形成的抑制率相似,约为25%。

图3 6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD对二羰基化合物形成的影响

2.5 硫酸化多糖对AGEs产物形成的影响

糖基化晚期,二羰基化合物与葡萄糖相比更容易与游离的氨基发生反应,通过氧化、水解和环化,形成不可逆的、具有荧光性质的、与蛋白质等大分子有交联性的糖基化终产物AGEs。结果表明,2种多糖硫酸化衍生物对AGEs形成均具有一定的作用,如图4所示。培养到第28天时,高剂量的6-O-SDHPD、2,2′,4-O-SDHPD的抑制率分别为45.6%和42.1%。