应用重组酶介导逆转录扩增技术快速登革病毒血清型鉴定

张 勤（通信作者） 王永亮 曹晓婉 郑州海关（河南，郑州，450003）

左 锋 天津海关（天津，300450）

邱英华 付玉和 杭州众测生物科技有限公司（浙江，杭州，310000）

登革热是由4 种血清型的登革病毒（denguevirus，DVI～Ⅳ）引起的、经伊蚊传播的急性传染病。登革病毒感染除引起登革热外， 严重的还会导致登革出血热或登革休克综合征。 登革热广泛流行于全球热带及亚热带的100 多个国家和地区，据世界卫生组织统计， 全球大约有25 亿人口受到该病的威胁，每年约有5100 万人感染登革热病毒，造成25000 人死亡［1，2］。四种登革病毒在抗原上是密切相关的，一种登革病毒诱导机体产生的抗体可与其他型别的登革病毒结合，非但不能中和异形病毒，反而导致感染后病情的加重， 发展为登革出血热或登革休克综合征［3］。监测与防控登革热已成为国际公共卫生亟待解决的问题， 对登革病毒进行快速检测和分型，具有重要意义。 本研究采用RAA 技术，以DV NS1 基因区段分别设计DVⅠ、DVⅡ、DVⅢ和DV Ⅳ特异性引物和探针， 建立快速、 准确DENV 分型鉴定体系， 为口岸登革病毒防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

登革病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清均为本实验室保存的确诊血清样本。

1.2 主要试剂及仪器

QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自德国Qiagen公司，RT-RAA 核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司，QIACUBE 全自动核酸提取仪购自Qiagen 公司，核酸蛋白检测仪购自BioDrop DUO 公司，Genchek-2 荧光检测仪购自杭州众测生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品RNA 提取

取140μL 血清样本，采用Qiagen RNA Mini Kit按试剂盒说明书及QIACUBE 全自动核酸提取仪使用要求提取样本总RNA。 BioDrop DUO 核酸蛋白检测仪测定核酸浓度，分装后保存于-80℃冰箱。

1.3.2 I 型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型登革病毒RT-RAA 引物、探针的设计合成与筛选

根据GenBank 公布的登革病毒序列号，进行多序列比对， 应用Oligo 7.0 软件分别设计引物和探针。RT-RAA 引物长度一般为28～33bp，探针长度为48～52bp，设计多条正向引物和反向引物，将上游引物和下游引物分别进行组合，分别对不同的引物组合进行实验，来对引物组合进行筛选。 引物探针由擎科生物技术有限公司合成。 所对比的登革病毒序列号：DV I 所对比的登革病毒序列号为：

KT751350.1，KT751349.1，KT751348.1，KT751347.1，KT751346.1，KF385907.1，KF385907.1，KF385906.1，KF385905.1，KF385904.1，KF385903.1，KF385902.1，KF385901.1，KF385900.1，KF385891.1，KF385890.1，KF385889.1，KF385888.1，KF385887.1，KM925074.1，KM925073.1，KR057905.1，KR057904.1，KR057903.1，AY089980.1，AY089979.1，X69396.1，X69395.1，KJ418180.1，KU509249.1，KU509250.1，KU509251.1，KU509252.1，KU509253.1，KU509254.1，KU509255.1，KU509256.1，KU509257.1，KU509258.1，KU509259.1，KU509260.1，KU509261.1，KU509262.1，KU509263.1，KU509264.1，KU509265.1，KU509266.1，KX225483.1，KX225484.1，KX225490.1，KX225489.1，KX225488.1，KX225487.1，KX225491.1，KX225492.1，KX225493.1，KX452051.1，KX452052.1，KX452053.1，KX452054.1，KX452055.1，KX452056.1，KX452057.1，KX452058.1，KX452059.1，KX452060.1，KX452061.1。 DV Ⅱ所对比的登革病毒序列号为：

Z17213.1，U51930.1，U51929.1，U51928.1，M58493.1，M58492.1，M58491.1，M58490.1，M58489.1，M58488.1，M58487.1，M58486.1，U19778.1，AF457574.1，X69191.1，KT751363.1，KT751362.1，KT751361.1，KT751360.1，KT751359.1，KT751358.1，AY422469.1，AY871815.1，KF385913.1，KF385912.1，KF385911.1，KF385910.1，KF385909.1，KX452031.1，KX452046.1，KR779786.2，KX452015.1，KX452016.1，KX452017.1，KX452018.1，KX452019.1，KX452020.1，KX452021.1，KX452022.1，KX452024.1，KX452025.1，KX452026.1，KX452027.1，KX452028.1，KX452029.1，KX452030.1，KX452032.1，KX452037.1，KX452038.1，KX452039.1，KX452040.1，KX452041.1，KX452042.1，KX452043.1，KX452045.1，KX621245.1，KX621246.1，KY427084.1，KY427085.1，KY627762.1，KY627763.1，KY921904.1，KY921905.1，KY923048.1，LC129169.1，LC129170.1。 DV Ⅲ所对比的登革病毒序列号为：U93298.2，U93295.2，U93294.2，U93302.2，U93301.2，U93303.1，U93300.1，U93299.1，U93297.1，U93296.1，AY422470.1，KF385930.1，KF385929.1，KF385928.1，KF385927.1，KF385926.1，KF385925.1，KF385924.1，KF385923.1，KF385922.1，KF385921.1，KF385920.1，KF385919.1，KF385918.1，KF385917.1，KF385916.1，KF385915.1，KF385914.1，KC261634.1，GU189648.1，GU370053.1，GU370052.1，KX380842.1，KX380841.1，KX380840.1，KX380839.1，JQ920489.1，JQ920488.1，JQ920487.1，JQ920486.1，JQ920485.1，JQ920484.1，JQ920483.1，JQ920479.1，JQ920480.1，JQ045695.1，JQ045693.1，JQ045691.1，JQ045692.1，JQ045689.1，JQ045687.1，AB214881.1，M93130.1，AB214881.1，KU216208.1，MF370226.1。DV Ⅳ所对比的登革病毒序列号为：KR011349.2，KP140942.1，KR922405.1，JQ915090.1，JQ915089.1，JQ915088.1，JQ915087.1，JQ915086.1，JQ915085.1，JQ915084.1，JQ915083.1，JQ915082.1，JQ915081.1，FJ196850.1，FJ196849.1，KU523872.1，KU523871.1，KT794007.1，KP406806.1，JF262780.1，KC333651.1，JX024758.1，JX024757.1，JQ822247.1，JF741967.1，JN983813.1，KY920910.1，KY920909.1，KU745648.1，KU745647.1，KU745641.1，KU745640.1，KU745639.1，KU745645.1，KU745644.1，KU745643.1，KU745642.1。

1.3.3 反应体系和反应程序

采用Genchek-2 荧光检测仪进行实时荧光RAA 检测，参照试剂盒说明书配制RAA 反应体系，总体积50μL ：A buffer 12.5μL，上下游引物各2μL，探 针0.6μL， 模 板2μL， 灭 菌ddH2O 28.4μL，B buffer2.5μL。 扩增条件设定在39℃，25min。

1.3.4 灵敏度检测

分别合成含有待检测DV I、DV Ⅱ、DV Ⅲ、DVⅣ基因序列的质粒， 将质粒梯度稀释为103、102、101copies/μl，检测方法的灵敏度。

1.3.5 特异性检测

用建立的方法分别检测黄热病毒阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、 四种登革病毒阳性血清进行检测，评价方法的特异性。

1.3.6 稳定性检测

用建立的方法重复检测黄热病毒阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、 四种登革病毒阳性血清4～6 次，评价方法的稳定性。

2 结果

2.1 引物的筛选及反应体系的建立

分别提取DV I 阳性血清、DV Ⅱ阳性血清、DVⅢ阳性血清、DV Ⅳ阳性血清核酸， 分别对DV I 7对引物组合、DV Ⅱ13 对引物组合、DV Ⅲ9 对引物组合和DV Ⅳ的5 对引物组合进行RT-RAA 扩增，根据对阳性样本检测中荧光值的强弱优选出引物探针，如表1 所示。 测定在50μL 反应体系中，当上下游引物工作浓度为10μmol/L 加入2μL，探针工作浓度为10μmol/L 加入0.6μL， 扩增温度为39℃，能获得最佳荧光吸收信号（见表1）。

2.2 灵敏度检测试验

表1 DVⅠ、DVⅡ、DVⅢ和DV Ⅳ特异性引物探针序列

测 定DV I、DV Ⅱ、DV Ⅲ、DV Ⅳ4 种 质 粒 浓度，以10 倍梯度稀释，进行RT-RAA 反应，结果如图1～图4 所示，5 分钟左右开始扩增，20 分钟可以完成，随着样品质粒浓度的降低，扩增时间相应延长，102copies/μl 浓度的样品都能被有效扩增。

图1 DV I 阳性质粒灵敏度试验结果

图2 DV Ⅱ阳性质粒灵敏度试验结果

图3 DV Ⅲ阳性质粒灵敏度试验结果

图4 DV Ⅳ阳性质粒灵敏度试验结果

2.3 特异性检测试验

提取基孔肯雅病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、四种登革病毒阳性血清核酸，分别用DV I、DV Ⅱ、DVⅢ、DV Ⅳ引物探针及DV 通用型引物探针对上述样本进行RT-RAA 扩增， 每个试验设4～6 个重复，结果如图5～图8 显示， 使用DV I 特异性引物探针进行扩增， 则仅DV I 阳性血清出现特异性扩增曲线；使用DV Ⅱ特异性引物探针分别检测上述样本，则仅DV Ⅱ阳性血清出现特异性扩增曲线， 使用DV Ⅲ特异性引物探针分别检测上述样本，则仅DVⅢ阳性血清出现特异性扩增曲线， 使用DV Ⅳ特异性引物探针分别检测上述样本， 则仅DV Ⅳ阳性血清出现特异性扩增曲线，而四种登革病毒特异性引物探针扩增基孔肯亚病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清均为阴性，说明所建立的RT-RAA 方法具有良好的特异性。

1 为DVI 阳性血清的扩增曲线；2 为DV Ⅱ阳性血清、DV Ⅲ阳性血清、DV Ⅳ阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清扩增曲线

图5 DV I 特异性试验结果

1 为DVⅡ阳性血清的扩增曲线；2 为DV I 阳性血清、DV Ⅲ阳性血清、DV Ⅳ阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清扩增曲线

图6 DV Ⅱ特异性试验结果

1 为DVⅢ阳性血清的扩增曲线；2 为DV I 阳性血清、DV Ⅱ阳性血清、DV Ⅳ阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清扩增曲线

图7 DV Ⅲ特异性试验结果

1 为DVⅣ阳性血清的扩增曲线；2 为DV I 阳性血清、DV Ⅱ阳性血清、DV Ⅲ阳性血清、基孔肯雅病毒阳性血清、黄热病毒阳性血清、乙型脑炎病毒阳性血清、寨卡病毒阳性血清扩增曲线

图8 DV Ⅳ特异性试验结果

2.4 重复性检测试验

如图5～图8 显示， 用建立的方法重复检测6次，荧光值相同，且扩增曲线走势差异较小，说明具有很好的重复性。

3 讨论

登革病毒的四种血清型在中国内陆均引起过登革热的暴发流行［4-8］。DV Ⅲ是早期（1978 年）报道的主要流行血清型病毒，随后则报道了DVⅠ和DVⅣ。郑夔等对在广东省四次暴发的登革热（1991 年、1995 年、1997 年和1999 年）中分离得到的DVⅠ病毒株序列进行了遗传分析，证实广东省的DVⅠ来源于菲律宾、 印尼和泰国等东南亚国家和西太平洋国家； 方美玉等对比分析了广东省1993 年和1998 年登革热暴发DVⅡ病毒株和1985 年海南省DVⅡ分离株NS1 序列， 表明它们来自于不同的传染源；姚海军等对1990 年和1978 年引起广东省登革热的DVⅣ毒株基因序列进行了分子溯源。 研究表明，基因组核苷酸序列分型和血清学分型法完全吻合［9］。

实时荧光RAA 技术是在普通RAA 的基础上，利用荧光染料在激发光作用下所释放荧光光能的变化来动态反映RAA 扩增产物量的新技术［10］。 本研究根据RAA 引物和探针设计原则， 分别设计了DVI～Ⅳ的引物和探针， 建立了实时荧光RT-RAA登革病毒血清型鉴定方法， 在39℃下等温反应20min，即可实现对靶基因的有效扩增，检测的灵敏度可达102copies/μl，试验的重复性好，又缩短了反应时间提高了工作效率。 此方法不但可以在实验室应用，还可以现场操作，有利于口岸登革病毒的准确、快速分型鉴定，该方法的建立为口岸登革热的筛查及溯源提供了技术保障。