结核感染T 细胞检测在赴美国移民体检结核感染筛查中的应用

栗召辉 梁武毅 黄永欣 朱云枫 明宏艳 梁少军 何洪涛 张建明 广州国际旅行卫生保健中心（广东，广州，510623）

结核病（tuberculosis，TB）是一个重要的全球公共卫生问题，全球约有20 亿人感染结核分枝杆菌，而儿童结核分枝杆菌感染率达到9%［1］。尽管世界各国对结核病采取了有效措施，但儿童结核病多无典型临床症状， 临床表现与普通感染性疾病不易区别，导致诊断困难，这也为全球到2035 年消除结核病的战略目标提出了挑战［2］。 结核菌素皮试（tuberculin skin test，TST） 是长期以来用以快速诊断结核感染的唯一手段。 然而TST 存在诸多缺陷：在易受结核感染的免疫力低下人群中，其敏感性反而大大降低；在普遍接种卡介苗（BCG）的地区造成非常高的“假阳性”率［3-4］。 此外，皮试的操作和结果的解释存在主观依赖性，降低了检查的准确性。T-SPOT.TB则是以特异性抗原为刺激源，应用酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）诊断结核感染的新方法。 使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells，PBMC），通过细胞因子γ 干扰素（IFNγ）的分泌检测抗原特异性T 淋巴细胞的应答反应情况，进而对患者的结核感染状态进行判断。 本研究通过对TST 和T-SPOT.TB 进行比较分析， 旨在探讨赴美移民体检结核病感染筛查中两种方法的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

按照美国CDC 有关移民人群结核病筛查的技术指导， 对2012 年1 月-2013 年10 月来我中心体检的2～14 岁移民申请人进行结核筛查。 其中2012年1-12 月共5 388 例申请人采用结构菌素试验（PPD） 试验；2018 年1-12 月共3 486 例采用TSPOT.TB 试验。

1.2 研究方法

1.2.1 PPD 组：在申请人左上肢前臂掌侧皮下注射0.1ml PPD 试剂（成都生物制品研究所），于48～72h内测量注射处硬结直径。 所有结果均由同一组检测人员判读。

1.2.2 T-SPOT.TB 组：肝素抗凝管采取5mL 外周静脉血；分离外周血单个核细胞（PBMCs）；收集外周血单个核细胞（PBMCs）并计数，配制每100μL 含有25万个细胞的标准溶液500μL；采用IGRA 试剂盒（上海复星长征医学科学有限公司）进行IGRA 检测；每个测定样本需4 个检测孔（空白对照、测试孔A 和测试孔B、阳性质控对照）；加入50μL 细胞培养液至每个空白对照孔内； 加入50μL 抗原A 溶液至每个必要的检测孔内； 加入50μL 抗原B 溶液至每个必要的检测孔内； 加入50μL 阳性质控至每个细胞功能控制孔内。 每个样本使用4 个检测孔，每个检测孔加入100μL 细胞终溶液 （含有25 万个活细胞）；然后在37℃，保持湿润的含有5%CO2的培养箱中孵育16～20h。 从培养箱中取出培养板，弃去细胞培养液；每个反应孔加入200μL PBS 缓冲液；弃去PBS 缓冲液； 用新鲜的PBS 缓冲液重复洗涤至少3遍； 用PBS 缓冲液200 倍稀释浓缩标记抗体试剂。每个反应孔加入50μL 标记抗体工作液，2～8℃孵育1h；弃去标记抗体工作液，按上述的步骤洗涤。 每个反应孔加入50μL 底物显色溶液，室温孵育7min。用蒸馏水彻底洗涤培养板终止反应； 把培养板放在37℃温箱干燥4h； 记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。

1.2.3 PPD 或T-SPOT.TB 阳性的申请人需进一步拍摄胸部后前位数字X 线片，设备为日本岛津公司生产的数字化X 线摄影系统。

1.3 结果判定

PPD 组：皮下硬结横径＜10mm 为阴性；皮下硬结横径≥10mm 为阳性。

T-SPOT.TB 组：①当阴性对照孔斑点数≤5 时，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑点数－阴性对照孔斑点数≥6 为阳性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑点数－阴性对照孔斑点数＜6 为阴性。②当阴性对照孔斑点数≥6 时，抗原A 孔和/或抗原B 孔斑点数≥2×阴性对照孔斑点数为阳性； 抗原A 孔和抗原B 孔斑点数＜2×阴性对照孔斑点数为阴性。

1.4 统计学处理

应用SPSS16.0 统计软件，采用卡方检验（Chi-Square test）进行统计学分析。 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组试验结果比较

5 388 例采用PPD 试验的2～14 岁移民申请人，阳性530 例， 阳性率为9.84%；3 486 例采用TSPOT.TB 试验的2～14 岁移民申请人，阳性61 例，阳性率为1.75%， 两种方法阳性率差异有统计学意义（χ2＝222.666，P＜0.01）。

2.2 X 线结果比较

PPD 试验阳性的移民申请人中X 光异常者6例，X 光异常发现率为1.13%（6/530）；T-SPOT.TB试验阳性的移民申请人中X 光异常者11 例，X 光异常发现率为18.03%（11/61）， 两种方法X 光异常发现率差异有统计学意义 （χ2＝55.930，P＜0.01）（见表1）。

表1 T-SPOT.TB 试验和PPD 试验的检出率（例）

3 讨论

我国是全球22 个结核病高负担国家之一，活动性肺结核的患病率为459/10 万［5］，其中儿童结核病约占全部结核病的10%［6-7］。 2000 年我国儿童活动性肺结核患病率为91.8/10 万， 其中痰细菌学检查阳性的儿童肺结核患病率为12.3/10 万［8］。 而2016 年我国0～14 岁儿童的结核病患者达到10 万人左右［9］。 美国CDC 制定的赴美移民体检指导指出，赴美移民2～14 岁的申请人必需进行（tuberculin skin test，TST） 或γ 干扰素释放分析结核菌素皮试实验（interferon-γ release assay，IGRA）试验来筛查肺结核。 TST 作为长期以来快速诊断结核感染的唯一手段，受卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）影响较大，在普遍接种BCG 的地区造成非常高的“假阳性”率，降低了检查的准确性。自从Lalvani 等［10］首先将ELISPOT（T-SPOT.TB 即为ELISPOT 诊断方法的商品化）用于活动性肺结核的诊断以来，T-SPOT.TB 的应用迅速发展。 T-SPOT.TB 继2004 年、2005年在欧洲和加拿大被批准使用后， 美国FDA 也在2008 年完成审批。 T-SPOT.TB 是目前IGRA 诊断结核感染的最主要方法之一。 T-SPOT.TB 以T 细胞免疫应答为基础的γ-干扰素（γ-IFN）释放实验，其原理是结核杆菌感染者外周血单核细胞（PBMC）中存在的特异性T 细胞在受到被RDl 编码抗原活化后分泌γ 干扰素，后者被微孔板上γ 干扰素抗体结合，通过显色形成色素沉淀斑点，从而诊断结核感染。

Cruz 等［11］在 对210 名 儿 童 的 前 瞻 性 研 究 中 发现，诊断为活动性肺结核儿童的T-SPOT.TB 的敏感病为92%，高于TST 的77%。 Lalvani［12］综合5 项研究总计1 136 例密切接触者后认为。 T-SPOT.TB 与BCG 接种无明显相关，提示了更高的特异度，且TSPOT.TB 与结核分枝杆菌暴露程度的相关性优于TST，显示了良好的灵敏度。Detjen 等［13］通过73 名结核患儿观察TST 和INF-γ 释放试验在儿童结核病中的诊断价值， 发现T-SPOT.TB 的特异度为98%，高于TST 的58%，而两者的敏感度均为100%。国内张卫平等［14］对0～14 岁75 例疑似肺结核患儿用两种方法对比分析显示，T-SPOT.TB 灵敏度为80.6%，特异度为89.5%， 假阴性率为19.4%， 假阳性率为10.5%。 在结核病组中，T-SPOT.TB 阳性率显著高于TST 试验（80.6% vs 48.4%）。 李明武等［15］对62 名例患儿进行对比分析研究显示，T-SPOT.TB 试验诊断儿童结核病的敏感度为90.6%，特异度为96.8%，而且受其它干扰因素的影响较小， 可用于儿童结核病的早期快速诊断。 孙琳等［16］通过对1990-2011 年TSPOT.TB 在儿童结核病和潜伏结核感染诊断筛查中的应用研究进行Meta 分析，结果显示PPD 试验因受卡介苗接种的影响，特异度较低；γ-干扰素释放试验不受卡介苗接种的影响而具有较高的特异度。 其他研究［17-18］也显示T-SPOT.TB 检测能显著提高结核诊断的灵敏度和特异度，有利于早期诊断和治疗。

本次研究结果显示， 针对2～14 岁的移民申请人，T-SPOT.TB 筛查结核感染的阳性率 （1.75%）明显低于PPD 试验的阳性率（9.84%）；而T-SPOT.TB阳性人群中X 光异常检出率（18.03%）显著高于PPD阳性人群（1.13%）。 由此可知，T-SPOT.TB 检测在赴美移民结核筛查中的敏感性和特异性优于PPD 试验。 根据赴美移民体检指导的要求，T-SPOT.TB 或PPD 试验阳性的2～14 岁申请人需进行胸部X 光检查，而T-SPOT.TB 试验可以排除BCG 的干扰，降低了假阳性率， 使大量的2～14 岁移民申请人避免了不必要的胸部X 光检查。

Brodie 等［19］研 究 显 示，T-SPOT.TB 阳 性 结 果 与肺结核密切接触史显著相关， 而TST 阳性结果受BCG 接种影响，T-SPOT.TB 诊断潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection，LTBI） 较TST 更加准确。Bakir 等［20］对908 名肺结核接触者儿童进行了前瞻性研究，T-SPOT.TB 结果为阳性的接触者中，最终11 名发展成为活动性结核， 其发生风险是TSPOT.TB 阴性接触者的3.86 倍。 而且与TST 相比，以T-SPOT.TB 为标准能够更加准确地诊断结核感染。 T-SPOT.TB 的斑点数越多，发生活动性结核的可能性越大，而且短期内有过结核接触史的患者TSPOT.TB 的斑点数较多时更有意义。 Janssens 等［21］研究了T-SPOT.TB 在鉴别潜伏结核和活动性结核中的作用，显示T-SPOT.TB 的检测数值在活动性结核患者中显著高于潜伏性结核感染人群，但仍难以区分活动性结核和潜伏性结核感染。 T-SPOT.TB 的斑点数虽然并不精确地与结核活动程度呈正相关，但仍然存在着结核活动程度越高斑点数越多的趋势。 其它研究［22-24］也显示如果T-SPOT.TB 的斑点数在短时间内显著增加， 则强烈提示体内结核活动，有必要给予预防性的治疗。 斑点数的检测对于结核病的治疗也能起到辅助性作用，同时对评估治疗效果有较高的应用价值。田建岭等［25］研究发现，T 细胞斑点数的数量可反映体内的结核分枝杆菌负荷，T细胞斑点数在活动性TB 患儿中显著高于LTBI 儿童，但还不能用于区分儿童活动性TB 与LTBI。

目前国内的研究大多还局限在少数的疑似结核或确诊结核病例，还没有对大规模的普通人群进行对比分析研究。 本研究对大量2～14 岁赴美移民申请人的结核筛查情况进行了分析。 赴美移民体检指导要求，TST 或T-SPOT.TB 试验阳性而胸部X 光正常的申请人应被指定为LTBI。经对比分析本研究也发现，T-SPOT.TB 试验较TST 更能准确地诊断LTBI。尽管很多研究结果表明，T 细胞斑点数还不能明确用于鉴定活动性TB 和LTBI，但T 细胞斑点数的数量越多，发生活动性结核的可能性越大。 我们可以加强T-SPOT.TB 试验阳性人群的后期随访，尤其是活动性肺结核接触者的随访。总之，T-SPOT.TB在赴美移民结核筛查中的优势明显优于PPD 试验。本研究的遗憾之处在于， 大多数人员入境美国后，其随访资料无法获得。