E-cadherin参与IL-24抑制肺癌细胞增殖和侵袭迁移的实验研究

宋秀婧 杨铁波 王明晖 刘仁龙 顾少岩 张 尧

(齐齐哈尔市第一医院呼吸内一科，齐齐哈尔 161000)

肺癌属于呼吸系统恶性肿瘤，其发生机制十分复杂，不仅与环境等外界因素有关，还与细胞内基因的表达调控有关[1]。IL-24是IL-10细胞因子家族成员之一，人体黑素细胞、脾细胞、胸腺细胞等都可以表达IL-24[2]。最近的研究报告显示，IL-24参与肿瘤的进展，过量的IL-24可以抑制肿瘤的生长，并且对于正常细胞生长没有影响[3]。在肺癌中的研究报道显示，IL-24转染后的肺癌细胞凋亡增多，细胞生长受到抑制，而对于正常的支气管上皮细胞没有影响，说明IL-24发挥诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌细胞生长的作用[4]。还有研究报道表明，IL-24还可以抑制卵巢癌、宫颈癌等肿瘤细胞的侵袭和迁移，并且可以上调肿瘤细胞中E-cadherin表达水平，IL-24抗肿瘤转移的作用可能与E-cadherin有关[5,6]。目前对于IL-24对肺癌细胞侵袭和迁移的影响和机制尚不明确。本实验以明确IL-24对肺癌细胞侵袭和迁移的影响和机制为目的，以肺癌细胞A549作为体外实验对象，以期为阐明IL-24抗肺癌作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 肺癌细胞A549购自武汉普诺赛生命科技有限公司；pcDNA3.1-IL-24、pcDNA3.1购自北京合生基因科技有限公司；IL-24抗体、MMP-9抗体购自美国Abcam；cDNA合成试剂盒购自美国BIOMIGA；E-cadherin shRNA和shRNA阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司；MMP-2、E-cadherin、Ki-67抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen。

1.2方法

1.2.1pcDNA3.1-IL-24转染和过表达效果检测 肺癌细胞中分别转染对照载体pcDNA3.1和IL-24过表达载体pcDNA3.1-IL-24，记为pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24，设置不转染载体的肺癌细胞为对照组。转染试剂为Lipofectamine 2000，步骤同转染试剂说明。细胞转染后2 d，用Real time PCR和Western blot方法测定过表达效果。

1.2.1.1Real time PCR 每组取106个细胞，分别添加800 μl的TRIZOL试剂提取RNA，最后添加DEPC水将RNA溶解，以紫外分光光度计测定A260nm和A280nm比值在1.8～2.0之间。常规方法合成cDNA，步骤同cDNA合成试剂盒，逆转录条件为：42℃孵育30 min，85℃孵育10 min。取cDNA，进行PCR反应，PCR包括：0.08 μl的上下游引物(20 μmol/L)、2 μl的cDNA模板、0.4 μl的TaqDNA聚合酶、10 μl的2×定量PCR Master Mix，最后添加ddH2O，共20 μl，PCR反应条件为：95℃孵育3 min ；95℃孵育12 s，62℃孵育40 s，40个循环。以2-ΔΔCt方法计算IL-24表达水平。β-actin引物：F-5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′，R-5′-TCATAC-TCCTGCTTGCTGAT-3′。IL-24引物：F-5′-AATAGG-GCTAGCGCCACCATGAATTTTCAACAGAGGCT-3′，R-5′-GAATTCGGTCTCCTCGAGGAGCTTGTAGAATTTCT-GCA-3′。

1.2.1.2Western blot 在细胞中添加裂解溶液，置于冰上孵育40 min，转移至离心管中，4℃，12 000 g离心10 min，吸取蛋白溶液(上清)，常规BCA方法测定各组蛋白浓度，再添加Loading Buffer煮沸5 min。SDS-PAGE凝胶电泳时每个孔内的蛋白样品量为30 μg，50 V电压条件下观察蓝色条带已经进入到分离胶及浓缩胶的分界处时，将电压调整到120 V，观察蓝色条带已经跑出分离胶时，停止电泳。设置300 mA电流转膜，把蛋白转移到PVDF膜上，转膜时间共100 min。取出PVDF膜，置于含5%牛血清白蛋白封闭液的平皿内反应2 h后，把PVDF膜再放置于抗体孵育袋中，添加IL-24一抗孵育液，封口后，置于4℃环境中过夜，按照同样的方法与二抗在室温中孵育2 h后，ECL发光，以Vision Workers LS分析条带的光密度值，内参设置为β-actin。

1.2.2MTT测定IL-24对肺癌细胞增殖影响 按照Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24分组方法将肺癌细胞接种到96孔板中，继续培养48 h。将培养板取出后，分别用移液枪在每个孔内添加10 μl的MTT，置于37℃中培养4 h。将培养板取出后，将孔内的液体吸弃，每孔加150 μl的DMSO，反应10 min后，置于酶标仪上测定490 nm的A值。

1.2.3Transwell小室测定IL-24对肺癌细胞侵袭和迁移影响 用含有1%胎牛血清的细胞培养液把Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24细胞均配制成每毫升含有105个的单细胞悬浮液，每组吸取200 μl 添加到Transwell小室的上室，同时吸取600 μl 含血清的细胞培养液至下室内，培养2 d 以后，将小室取出，取棉签将聚碳酸酯膜表面的细胞清除掉，添加PBS将膜洗涤2次，晾干，添加甲醛固定，结晶紫染色，在400倍光学显微镜下计数细胞迁移数目。细胞侵袭实验同上，侵袭实验前用1∶6稀释的基质胶把Transwell小室湿化。

1.2.4Western blot检测IL-24对肺癌细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表达影响 取Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-IL-24细胞培养2 d 以后，按照Western blot方法检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表达变化，步骤同1.2.1.2。

1.2.5E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24共转染对肺癌细胞增殖、侵袭迁移影响 在肺癌细胞中共转染E-cadherin shRNA和pcDNA3.1-IL-24，同时共转染shRNA阴性对照和pcDNA3.1-IL-24，分别设置为pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin和pcDNA 3.1-IL-24+shRNA-NC。按照上述MTT、Transwell小室和Western blot检测细胞增殖、侵袭迁移和E-cadherin、MMP-2、MMP-9、Ki-67蛋白表达变化。

2 结果

2.1pcDNA3.1-IL-24提高肺癌细胞中IL-24表达水平 在肺癌细胞中转染pcDNA3.1-IL-24，细胞中IL-24 mRNA和蛋白水平均升高。pcDNA3.1-IL-24提高肺癌细胞中IL-24的表达。见图1和表1。

2.2过表达IL-24抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移 在肺癌细胞中转染pcDNA3.1-IL-24，细胞A490、侵袭数目、迁移数目及侵袭迁移蛋白MMP-9、MMP-2、增殖蛋白Ki-67表达水平均降低。过表达IL-24抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移。见图2和表2。

2.3过表达IL-24上调肺癌细胞中E-cadherin蛋白表达 在肺癌细胞中转染pcDNA3.1-IL-24，细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高。过表达IL-24上调肺癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平。见图3和表3。

2.4E-cadherin shRNA逆转过表达IL-24抗肺癌细胞增殖侵袭和迁移作用 在肺癌细胞中共转染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，细胞侵袭迁移数目和A490均高于共转染pcDNA3.1-IL-24和shRNA阴性对照的肺癌细胞。见表4。E-cadherin shRNA逆转过表达IL-24抗肺癌细胞增殖侵袭和迁移作用。

图1 Western blot检测pcDNA3.1-IL-24转染后肺癌细胞中IL-24蛋白表达水平Fig.1 Western blot detection of IL-24 protein expression level in lung cancer cells transfectad with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsIL-24mRNAIL-24proteinControl1.00±0.090.23±0.04pcDNA3.11.01±0.130.22±0.06pcDNA3.1-IL-242.35±0.241)0.43±0.05F65.70616.403P0.0000.004

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

2.5E-cadherin shRNA逆转过表达IL-24抗肺癌细胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表达作用 在肺癌细胞中共转染pcDNA3.1-IL-24和IL-24 shRNA，细胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低，与共转染pcDNA3.1-IL-24和shRNA阴性对照的肺癌细胞比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4和表5。E-cadherin shRNA逆转过表达IL-24抗肺癌细胞中MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表达作用。

图2 Western blot检测pcDNA3.1-IL-24转染后肺癌细胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白表达水平Fig.2 Western blot detection of MMP-9,MMP-2 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells transfected with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

GroupsE-cadherinControl0.13±0.02pcDNA3.10.14±0.04pcDNA3.1-IL-240.25±0.031)F13.759P0.006

Note：Compared pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationMMP-9MMP-2Ki-67Control0.45±0.0568.54±8.35135.64±12.080.67±0.080.64±0.060.53±0.05pcDNA3.10.44±0.0367.12±7.69133.80±10.650.70±0.060.65±0.040.54±0.03pcDNA3.1-IL-240.26±0.031)31.46±3.271)73.41±6.971)0.28±0.041)0.19±0.021)0.22±0.031)F23.93028.46936.64642.595110.94669.279P0.0010.0010.0000.0000.0000.000

Note：Compared with pcDNA3.1，1)P<0.05.

GroupsA490NumberofinvasionNumberofmigrationpcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.27±0.0234.81±5.1670.98±8.12pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.38±0.031)54.16±4.781)98.63±7.551)t5.2844.7654.319P0.0060.0090.013

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

GroupsE-cadherinMMP-9MMP-2Ki-67pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC0.29±0.050.24±0.060.21±0.030.21±0.05pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin0.16±0.021)0.56±0.051)0.35±0.041)0.34±0.051)t4.1817.0974.8503.184P0.0140.0020.0080.033

Note：Compared with pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC，1)P<0.05.

图3 Western blot检测pcDNA3.1-IL-24转染后肺癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平Fig.3 Western blot detection of E-cadherin protein expression in lung cancer cells after transfection with pcDNA3.1-IL-24Note: 1.Control；2.pcDNA3.1；3.pcDNA3.1-IL-24.

图4 Western blot检测 pcDNA3.1-IL-24和E-cadherin shRNA共转染后肺癌细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9和Ki-67蛋白表达水平Fig.4 Western blot detection of E-cadherin,MMP-2,MMP-9 and Ki-67 protein expression levels in lung cancer cells co-transfected with pcDNA3.1-IL-24 and E-cadherin shRNANote: 1.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-NC;2.pcDNA3.1-IL-24+shRNA-E-cadherin.

3 讨论

IL-24是新发现的肿瘤抑制基因，其是在黑色素瘤细胞中发现的，后续人们根据其染色体定位、细胞因子样特性等方面综合考虑将其归于IL-10家族，其可以高效且具有选择性地发挥抗肿瘤作用，具有调节免疫系统等功效[7-9]。很多研究报道显示，在肿瘤细胞中转染IL-24可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长侵袭和迁移，IL-24是一个具有潜力的肿瘤抑制因子[10]。目前在宫颈癌细胞中的研究报道表明，IL-24可以在体外抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移，在黑色素瘤细胞中也发现IL-24具有抗肿瘤侵袭的作用[11,12]。在肺癌细胞中已经验证发现转染IL-24可以抑制肺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡发生，说明IL-24在肺癌中可能也发挥抑制作用[13]。本次实验在肺癌细胞中转染IL-24，发现过表达IL-24后的肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力均降低，这提示，IL-24具有抗肺癌细胞增殖侵袭和迁移的作用，说明IL-24是一个肺癌发生和转移抑制因子，对于其在其他各株肺癌细胞和肺癌体内转移中的作用尚不清楚，还需要在以后的实验中进行验证。

肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移等均受到细胞内多种基因的调控作用，目前已知Ki-67是细胞增殖活性的标志蛋白，其表达水平越高表明细胞增殖能力越强，反之其表达水平降低后标志着细胞增殖能力下降[14]。肿瘤细胞从原来的位置脱落经过血管或淋巴管进入到远端组织恶性增殖形成转移灶的过程需要细胞外基质降解酶的作用，肿瘤细胞合成细胞外基质降解酶是肿瘤细胞转移和侵袭的基础[15,16]。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家族，而基质金属蛋白酶是细胞外基质降解的主要原因，MMP-2和MMP-9也是目前发现与肿瘤转移关系最为密切的蛋白酶[17,18]。本次实验发现过表达IL-24后的肺癌细胞中MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白水平均降低，说明IL-24具有抗肺癌细胞侵袭迁移和增殖的作用，这与检测细胞增殖、侵袭和迁移结果一致。

目前对于IL-24抗肿瘤机制研究尚不明确，在肝细胞癌细胞中的研究发现，IL-24高表达后的肝癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，后续在宫颈癌等肿瘤中也证实IL-24可以提高E-cadherin蛋白表达水平，IL-24作用机制可能与E-cadherin有关[19，20]。本实验证实，过表达IL-24后的肺癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，并且下调E-cadherin可以逆转过表达IL-24对肺癌细胞增殖侵袭和迁移的作用，这提示IL-24通过上调E-cadherin的表达抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移。

总而言之，IL-24具有体外抗肺癌细胞增殖、侵袭和迁移的作用，其作用机制与上调E-cadherin有关，这为研究IL-24的抗肿瘤机制提供了参考，在肺癌细胞中表达外源性的IL-24可能是治疗肺癌的潜在途径。