miRNA27a靶向GOLM1对非小细胞肺癌生物行为学的影响①

郑 兴 吴兆红 陈岗东 王戈菲 潘有光 (广州医科大学附属第三医院心胸外科，广州 510150)

肺癌是临床上常见的呼吸系统恶性肿瘤，其死亡率在所有类型的恶性肿瘤中高居榜首，5年生存率仅为15%左右[1]。肺癌的主要病理类型为小细胞肺癌(small lung cancer，SLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小细胞肺癌约占总发病率的85%[2]。非小细胞肺癌发病隐匿，易发生转移和复发，因此对其发病机制的研究已成为非小细胞肺癌早期诊断和临床治疗的重中之重。微小RNA(miRNA)是广泛存在于动植物中的一类具有调控功能的非编码小分子RNA，全长约为18～25个核苷酸，主要通过互补配对的形式与其靶基因的3′非编码区结合，进而诱导靶基因的降解或抑制靶基因的翻译[3]。研究显示，miR-27a在乳腺癌、胃癌、肾癌、肝癌、食管癌等多种恶性肿瘤中表达异常，并密切参与肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡等病理生理过程[4,5]。本研究旨在探究miR-27a在非小细胞肺癌中的生物学功能及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人非小细胞肺癌细胞系A549购自上海中国科学院生物化学与细胞生物学研究所，30只SPF级，7周龄，体重(20～22)g的BALB/c雄性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术公司。RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司。plenti-GFP空载和plenti-GFP-miR-27a慢病毒载体由上海吉玛制药技术公司构建，GOLM1-WT和GOLM1-Mut荧光素酶报告载体由深圳市盎然生物技术有限公司构建。PEG8000、嘌呤霉素均购自上海生工生物工程有限公司。GOLM1兔单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔二抗购自英国Abcam公司，Dual-Luciferase®Reporter Assay System荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。Transwell细胞小室购自美国Corning公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1miR-27a慢病毒包装及稳定细胞系构建 plenti-GFP空载或plenti-GFP-miR-27a慢病毒载体分别与包装质粒pMD2.0G和pAXAS2共同转染HEK293T细胞，转染12 h后更换新鲜培养基，在转染48 h、60 h、72 h时分别收集细胞上清病毒溶液。将收集所得病毒溶液合并，将病毒上清与PEG8000以30∶7.5的比例进行混合，4℃静置过夜。4 000 g离心20 min，弃上清，病毒沉淀用RPMI1640培养基重悬。随后将病毒加入到对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549中，感染48 h后，用1 μg/ml的嘌呤霉素筛选未感染细胞，荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，待细胞全部表达绿色荧光时表明慢病毒稳定细胞系构建成功。构建成功细胞系分别为miR-27a NC组和miR-27a OE组。

1.2.2荧光素酶分析miR-27a与GOLM1靶向关系 根据miRNA生物信息学网站(http://www.targetscan.org/)预测miR-27a可能的靶基因为GOLM1，并分析miR-27a与GOLM1之间的作用片段序列。设计野生型GOLM1-3′-UTR(GOLM1-WT)及缺失miR-27a结合区域的突变体GOLM1-3′-UTR(GOLM1-Mut)序列，并构建荧光素酶报告载体。将GOLM1-WT和GOLM1-Mut分别转染miR-27a NC和miR-27a OE细胞系，48 h后采用荧光素酶双报告基因检测试剂盒测定细胞荧光素酶活性，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3Western blot检测GOLM1蛋白表达水平 收集miR-27a NC组、miR-27a OE组以及未转染Control组对数生长期A549细胞1×106个，加入100 μl 1×SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，SDS-PAGE电泳，转膜，PVDF膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入用封闭液稀释的GOLM1兔单克隆抗体(1∶5 000),4℃孵育过夜。次日PBST洗涤6 min，重复3次，然后加入封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育60 min，PBST洗涤6 min，重复3次，ECL化学发光液进行显影，以GAPDH作为内参。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖活力 miR-27a NC组、miR-27a OE组以及未转染Control组对数生长期A549细胞用胰酶消化后，调整细胞浓度至5×105个/ml，以每孔100 μl的量接种于96孔板内，37℃、5% CO2培养12 h至细胞贴壁。每孔分别于24、36、48和72 h时加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h后，在450 nm处测定各孔吸光度值。每组细胞每个时间点均设置3个复孔。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭能力 miR-27a NC组、miR-27a OE组以及未转染Control组对数生长期A549细胞用胰酶消化后，调整细胞浓度至5×105个/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于Transwell上室，下室加入500 μl RPMI1640完全培养基，37℃、5% CO2培养24 h后，PBS漂洗2次，多聚甲醛固定20 min，用棉签轻轻擦掉上室未侵袭的细胞。结晶紫染色5 min，自来水冲洗结晶紫染料，适当风干Transwel膜，显微镜下随机计数5个视野，统计并分析两组细胞的侵袭个数。

1.2.6TUNEL检测细胞凋亡情况 miR-27a NC组、miR-27a OE组以及未转染Control组对数生长期A549细胞用胰酶消化后，调整细胞浓度至5×105个/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于96孔板内，37℃、5% CO2培养24 h至细胞贴壁。PBS洗涤1次，用含0.3%TritonX-100的PBS室温孵育5 min，PBS洗涤2次，加入50 μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜下观察染色效果。

1.2.7体内移植瘤实验分析小鼠体内成瘤和转移情况 miR-27a NC组、miR-27a OE组以及未转染Control组对数生长期A549细胞重悬于PBS并调整浓度至5×107个/ml，取100 μl细胞悬液接种于BALB/c裸鼠腋下脂肪垫，于SPF级动物房内继续饲养，每天观察并记录各组小鼠皮下肿瘤的生长状况，32 d后处死小鼠并解剖腹腔，显微镜下观察腹膜内肿瘤转移灶。肿瘤体积(V)= 0.52×长×宽2。

2 结果

2.1miR-27a与GOLM1靶向关系的验证 通过生物信息学在线预测软件分析miR-27a可能的作用靶点为GOLM1，miR-27a与GOLM1 mRNA 3′UTR区的互补序列见图1A。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与转染GOLM1-WT的miR-27a NC组细胞相比，转染GOLM1-WT的miR-27a OE组细胞的荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)，而转染GOLM1-Mut后的miR-27a NC组和miR-27a OE组细胞的荧光素酶相对活性无显著性差异(P>0.05)，见图1B。表明GOLM1是miR-27a的作用靶点。

图1 miR-27a与GOLM1靶向关系的验证Fig.1 Verification of miR-27a and GOLM1 targeting relationshipNote:Compared with the miR-27a NC group in GOLM1-WT,*.P<0.05.

2.2miR-27a过表达对GOLM1蛋白水平的影响 Control组、miR-27a NC组和miR-27a OE组细胞的GOLM1蛋白相对表达水平分别为1.35±0.08、1.31±0.09和0.54±0.05。与Control组和miR-27a NC组相比，miR-27a OE组细胞GOLM1的蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，Control组和miR-27a NC组细胞GOLM1的蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)，见图2。表明miR-27a可负向调控GOLM1的表达。

图2 miR-27a过表达对GOLM1蛋白水平的影响Fig.2 Effect of miR-27a overexpression on GOLM1 protein

2.3miR-27a 对A549细胞增殖活力的影响 与Control组和miR-27a NC组相比，在24、36、48和72 h四个时间段miR-27a OE组细胞的增殖活力均受到显著的抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，Control组和miR-27a NC组细胞增殖活力差异无显著统计学意义(P>0.05)，见图3。

图3 miR-27a 过表达对A549细胞增殖活力的影响Fig.3 Effect of miR-27a overexpression on proliferation of A549 cells

2.4miR-27a对A549细胞侵袭能力的影响 为了进一步评估miR-27a对A549体外转移的影响，采用Transwell检测A549过表达miR-27a后细胞侵袭能力的变化。结果显示，与Control组(80.26±8.03)个和miR-27a NC组(77.51±10.18)个相比，miR-27a OE组(39.66±5.74)细胞的侵袭能力受到显著的抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 miR-27a 过表达对A549细胞侵袭的影响Fig.4 Effect of miR-27a overexpression on invasive ability of A549 cells

2.5miR-27a过表达对A549细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示，与Control组(49.17±6.56)个和miR-27a NC组(44.84±7.01)个相比，miR-27a OE组(82.49±9.70)个细胞凋亡数量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 miR-27a 过表达对A549细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of miR-27a overexpression on apoptosis of A549 cells

2.6miR-27a 过表达对裸鼠皮下移植瘤的影响 裸鼠成瘤实验结果显示，miR-27a OE组肿瘤生长速度显著低于Control组和miR-27a NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。miR-27a OE组小鼠体内成瘤后腹膜内的转移病灶数量(8.85±1.57)也显著低于Control组(14.25±3.04)和miR-27a NC组(14.69±2.73)小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

图6 裸鼠皮下移植瘤体积比较Fig.6 Comparison of subcutaneous transplantation tumor volume

3 讨论

高尔基体膜蛋白(golgi membrance protein 1，GOLM1)又称GOLPH2和GP73，是一种定位于高尔基体顺面囊膜的Ⅱ型高尔基体膜糖蛋白[6]。GOLM1的表达具有上皮细胞特异性，在胆管、肝、肾、肠、前列腺等上皮细胞中发挥多种功能，是维系正常细胞功能和内脏器官生长发育的重要蛋白[7,8]。研究发现GOLM1在肝癌、肾癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达，并与肿瘤的发生和转移密切相关[9,10]。最新的研究表明GOLM1在非小细胞肺癌中高表达，密切参与肿瘤细胞的侵袭和转移，并与患者的不良特征密切相关[11-13]。本研究通过生物信息学分析发现GOLM1的3′UTR区存在miR-27a的多个碱基结合位点，可能是miR-27a的作用靶点，因此我们采用荧光素酶报告系统验证了GOLM1是miR-27a的下游靶基因，提示miR-27a可能通过靶向GOLM1的mRNA进而调控其蛋白表达。Western blot结果进一步显示过表达miR-27a可显著下调GOLM1的蛋白表达水平。综合以上结果，我们推测miR-27a靶向调控GOLM1基因可能在非小细胞肺癌的发生于发展中起到关键作用。

研究显示miR-27a在乳腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、肝癌等不同恶性肿瘤中可与多个靶基因结合从而发挥其促癌或抑癌功能[14,15]。如miR-27a可通过抑制MXI1或PHB的表达而促进或抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭[16,17]。目前尚未有研究报道miR-27a对非小细胞肺癌生物行为学的影响。为了进一步阐明miR-27a在非小细胞肺癌中的发病机制，我们通过构建miR-27a过表达A549稳定细胞系，检测miR-27a过表达对A549细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。结果显示，miR-27a过表达后，细胞增殖活力和侵袭能力均受到显著抑制，细胞凋亡率则明显增加。动物体内实验也表明miR-27a过表达的裸鼠皮下移植瘤生长速度及其腹膜内转移病灶水平均显著低于对照组，提示过表达miR-27a可抑制非小细胞肺癌的发展和转移。

综上所述，本研究综合细胞水平和动物水平实验证明了miR-27a可通过下调GOLM1的蛋白表达，抑制非小细胞肺癌肿瘤细胞的增殖和侵袭，并促进癌细胞的凋亡，有望为非小细胞肺癌的临床治疗提供新的思路。但需要注意的是可能还存在其他靶基因受miR-27a的调控，进而抑制非小细胞肺癌的发生发展，这些工作还需未来更加深入的研究和探索。