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圣草次苷调控MPTP诱导的慢性小鼠帕金森疾病和机制研究①

2020-02-20张晓愉张昆鹏王建民赵晓辉邢台市人民医院神经内科邢台054000

中国免疫学杂志 2020年3期
关键词:旷场低剂量脑组织

张晓愉 张昆鹏 王建民 赵晓辉 (邢台市人民医院神经内科,邢台 054000)

帕金森(Parkinson′s disease,PD)又称为震颤麻痹,是一种常见的神经系统变性疾病,多发于老年人[1,2]。PD主要是由于黑质致密部多巴胺能神经元变性、坏死引起,PD患者脑组织病理改变表现为黑质致密部多巴胺能神经元严重缺失,现阶段尚无彻底治疗的方法[3,4]。圣草次苷又称为圣草枸楷苷,是一种常见的黄铜类中药,可减轻氧化应激损伤、降血脂,其抗氧化能力强于橙皮苷、柚皮苷等,同时可以降低血脂[5]。本实验给大鼠注射MPTP制成PD模型,并使用圣草次苷处理,旨在研究圣草次苷对PD疾病的影响,以期了解圣草次苷对PD治疗的作用机理,从而为PD的治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级3周龄SD小鼠75只,购自广东医学院实验动物中心,粤监证字 2004A029号,所有小鼠分15个笼子饲养,每个笼子5只。所有小鼠均在本院动物中心实验室饲养,饲养温度20~25℃,相对湿度50%~65%,该实验经过动物伦理委员会批准同意。

1.1.2药物与试剂 圣草次苷(产品编号:E52220;CAS:13463-28-0;纯度>98%;分子式:C27H32O15,水溶性)购自上海吉至生化科技有限公司;甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶购自百灵威科技有限公司;苏木素、伊红购自武汉博士得生物有限公司;中性福尔马林、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH)检测试剂盒均购自上海恒远生物科技有限公司;Caspase-3抗体(批号:31A1067201806)购自碧云天公司;Caspase-9抗体(货号:sc-56076;批号:20190401)、Bcl-2抗体(货号:sc-7382;批号:20190201)、Bax抗体(货号:sc-7480;批号:20190301)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;诱生型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)ELISA试剂盒购自安徽大千生物;白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒购自美国贝克曼库尔特有限公司;TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(批号:11684817910)购自美国罗氏公司;HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司。

1.1.3仪器 Sysmex-chemix-180 型全自动生化分析仪购自日本 Furuno Electric公司;BS-124s 型电子天平购自北京赛多斯仪器系统有限公司;TGL-16M低温离心机购自济南来宝医疗器械有限公司;SG-51正置型金相显微镜购自上海光学仪器厂;蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司;凝胶成像系统购于以色列DNR公司;LD-66实验室切片机购自长沙益广制药机械公司。

1.2方法

1.2.1分组及建立模型 将75只小鼠适应性喂养1周,采用随机分组法分为:健康对照组(Control)、模型组(MPTP)、圣草次苷低剂量组(Eriocitrin 8 mg/kg)、圣草次苷中剂量组(Eriocitrin 16 mg/kg)、圣草次苷高剂量组(Eriocitrin 32 mg/kg),每组各15只;将模型组、圣草次苷低剂量组、圣草次苷中剂量组、圣草次苷高剂量组小鼠制成帕金森小鼠模型,制作方法参考赵梦蝶等[6]研究具体操作如下:腹腔注射20 mg/(kg·d)的MPTP溶液,持续一周制成帕金森小鼠模型,完成造模后,腹腔注射啊扑吗啡 0.5 mg/kg,10~15 min大鼠出现单侧旋转现象,持续记录30 min,若旋转圈数平均>7 r/min,即为造模成功。

1.2.2药物干预 将水溶性圣草次苷溶解于生理盐水中,按照剂量配置圣草次苷水溶液。圣草次苷低剂量组(80 mg/kg)、圣草次苷中剂量组(16 mg/kg)、圣草次苷高剂量组(32 mg/kg)使用圣草次苷灌胃处理,模型组和空白对照组使用等量的生理盐水处理。

1.2.3检测项目

1.2.3.1小鼠行为学实验 小鼠行为学实验采用:旷场实验、悬挂实验和游泳实验,三个实验均在同一天进行。旷场实验:旷场装置由黑色方形基座和黑色墙壁组成。将小鼠放置在房间的角落,适应1 min后,使用视频计算机跟踪系统记录小鼠自发活动5 min 运动路程与停留时间。

小鼠完成旷场实验后休息2 h开始悬挂实验,将小鼠悬挂在水平尼龙线上,离开地面20 cm,记录小鼠能用一只爪抓住尼龙绳的时间。

小鼠完成悬挂实验后休息2 h开始游泳实验:将小鼠放入水池中,水池大小为30×30×30 cm,水温为28℃,记录小鼠游泳力竭开始下沉时间。

1.2.3.2HE染色和TUNEL染色 完成小鼠行为实验后使用断颈法处死小鼠,去小鼠脑组织,使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脱水、苏木精浸泡、盐酸酒精分化、冲洗、伊红染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡,分别采用TUNEL 染色和HE染色,最后中性树胶封片即可。在10×40的倍镜观察小鼠脑组织凋亡情况。

1.2.3.3Western blot 检测蛋白表达水平 使用Western blot 检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白,取小鼠脑组织,使用胰蛋白酶消化后,提取总蛋白,使用半干法将蛋白转移到PVDF膜,置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗,二抗,孵育2 h,以β-actin为内参蛋白,采用显色液显色后行吸光度分析,计算各蛋白相对表达量。

1.2.3.4ELISA检测 取小鼠脑组织,剪碎并使用胰蛋白酶制成匀浆,严格按照酶联免疫吸附法试剂盒测操作,测定小鼠肝组织中IL-6、TNF-α、iNOS和IL-10含量水平。

2 结果

2.1小鼠行为学实验检测结果 由表1小鼠行为学实验可以看出,相比健康对照组,模型组小鼠旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间和悬挂时间均显著降低(P<0.05);相比模型组,圣草次苷低剂量组旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间和悬挂时间均无显著变化(P>0.05),圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间和悬挂时间显著升高(P<0.05)。

2.2染色观察小鼠神经元凋亡情况 由图1 HE染色和TUNEL染色可以看出,空白对照组小苏神经元细胞分布均匀,且基本无坏死;模型组小鼠组神经细胞分布散乱,且数量缺失明显增多,坏死细胞较多;圣草次苷低剂量组,细胞分布较为散乱,有较多的细胞缺失和坏死;圣草次苷中剂量组神经细胞分布较为整齐,少量神经细胞缺失和坏死。

2.3小鼠脑组织凋亡相关蛋白表达情况 由表2蛋白质印迹实验可以看出,相比空白对照组,模型组小鼠Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05);相比模型组,低剂量组Caspase-3蛋白表达无显著差异(P>0.05);相比模型组,使用圣草次苷处理各组小鼠Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平显降低(P<0.05)。

2.4试剂盒检测小鼠黑质中相关物质含量水平 由表2可以看出,相比空白对照组,模型组小鼠SOD水平显著降低,MDA、LDH、GSH水平显著升高(P<0.05);相比模型组,圣草次苷低剂量组MDA、SOD、LDH、GSH水平均无显著变化(P>0.05);相比模型组,圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组MDA、LDH、GSH水平显著降低,SOD水平显著升高(P<0.05)。

2.5ELISA检测小鼠外周血相关物质含量水平 由表3 ELISA 检测结果可以看出,相比空白对照组,模型组小鼠TNF-α、IL-6、iNOS水平显著升高(P<0.05),IL-10无显著变化(P>0.05);相比模型组,圣草次苷低剂量组TNF-α、IL-6、iNOS、IL-10水平均无显著变化(P>0.05);相比模型组,圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组TNF-α、IL-6、iNOS水平显著降低,IL-10水平显著升高(P<0.05)。

GroupsnField travel(cm)Activity time(s)Swimming time(s)Hang time(s)Control153 324.56±132.366.13±0.39153.12±10.92123.65±12.32MPTP152 067.31±113.121)3.08±0.451)62.13±9.031)56.52±7.841)Eriocitrin(8 mg/kg)152 106.45±109.673.14±0.2464.06±8.2860.12±8.73Eriocitrin(16 mg/kg)152 698.12±138.542)4.52±0.522)96.54±11.332)84.26±11.172)Eriocitrin(32 mg/kg)152 916.87±126.492)5.77±0.472)123.25±13.022)103.97±14.932)

Note:1)P<0.05,compared with Control group;2)P<0.05,compared with MPTP group.

2.6蛋白质印迹检测相关信号通路蛋白表达情况 由图2蛋白质印迹实验可以看出,相比空白对照组,模型组小鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);相比模型组,使用圣草次苷处理各组小鼠脑组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

图1 染色观察小鼠神经元凋亡情况

GroupsnMDA(mmol/ml)SOD(U/ml)LDH(U/L)GSH(U/ml)Control152.15±0.317.03±0.81789.39±125.0442.05±4.58MPTP155.42±0.541)2.18±0.571)2134.61±284.591)94.27±8.211)Eriocitrin(8 mg/kg)155.28±0.462.54±0.262091.42±234.6291.34±6.73Eriocitrin(16 mg/kg)153.62±0.352)5.14±0.392)1432.39±135.782)65.06±8.192)Eriocitrin(32 mg/kg)152.74±0.522)7.53±0.422)923.48±107.132)53.18±7.522)

Note:1)P<0.05 means comparison with healthy control group;2)P<0.05 means comparison with model group.

GroupsnTNF-α (pg/ml)IL-6(pg/ml)iNOS (pg/ml)IL-10 (pg/ml)Control1545.38±6.5412.39±3.0954.64±8.828.17±1.67MPTP15234.24±25.841)86.27±11.251)201.42±23.481)9.73±1.88Eriocitrin(8 mg/kg)15219.48±19.4284.56±9.34196.43±26.6610.69±2.36Eriocitrin(16 mg/kg)15126.73±16.842)49.81±6.122)125.62±15.282)14.36±2.052)Eriocitrin(32 mg/kg)1579.48±11.922)26.15±5.172)84.32±8.932)22.21±3.532)

Note:1)P<0.05,compared with Control group;2)P<0.05,compared with MPTP group.

图2 小鼠脑组织凋亡相关蛋白表达情况

图3 蛋白质印迹检测相关信号通路蛋白表达情况

3 讨论

神经功能评分是衡量PD严重程度的重要指标之一,PD患者黑质致密部多巴胺能神经元变性坏死会使得行为受到一定的限制和滞后[7]。本研究发现,相比模型组圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组旷场移动路程、旷场中心区域活动时间、游泳时间和悬挂时间显著升高,但圣草次苷低剂量组则无显著变化。说明使用圣草次苷可以有效改善小鼠神经功能,但当剂量低于16 mg/(kg·d)时无显著效果。

神经细胞的凋亡是为了维持内环境稳定,且受到凋亡相关基因控制,但当神经凋亡过多则会导致神经功能受到影响[8]。caspase家族基因是控制凋亡的重要基因之一,当细胞凋亡途径激活后,上游信号经传递能够激活下游caspase-9的活化,放大凋亡信号,激活caspase-3,而凋亡信号一旦传递到caspase-3蛋白活化,细胞凋亡进入不可逆阶段[9,10]。除了caspase家族,Bcl-2家族也是控制细胞凋亡的重要基因之一,主要包括Bcl-2和Bax这两种蛋白表达量决定细胞是否凋亡[11-13]。Bax和Bcl-2表达呈相反趋势,当Bcl-2表达下降时 Bax 表达上升,此时会促进细胞的凋亡;当Bcl-2 表达升高,而 Bax 表达降低时,则会抑制细胞的凋亡。本实验中可以看出,相比模型组,使用圣草次苷处理各组小鼠Bax/Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平显降低,同时可以从HE染色和TUNEL染色实验看出,使用圣草次苷处理后小鼠脑神经细胞凋亡显著降低,说明圣草次苷可以降低相关凋亡蛋白的表达,促进抑制凋亡的蛋白表达,实现抑制脑神经细胞的凋亡,保护神经细胞的作用。

炎症反应时影响PD的重要参数之一,其中TNF-α是一种多功能的调控炎症因子,其可以通过直接或间接的形式加速脂质对血管的穿透作用,促进脂纹和斑块的形成[14];iNOS的高表达,降低血管的收缩能力,会引起脑血管狭窄导致供血不足影响神经细胞功能;IL-10是抑炎症因子,升高其含量水平可以有效抑制炎症反应,缓解炎症带来的损伤[15]。氧化应激也是加重PD症状的重要因素之一。抗氧化体系主要包括酶系和非酶系两大类,酶系中,最主要的是SOD,其含量多少可以直接反应氧化应激的程度[16]。同时MAD含量增加,并且会使得患者机体的抗氧化能力减弱,导致脑细胞和线粒体膜受损,引起血清丙氨酸转氨酶升高,同时也会使得脑组织游离脂肪酸水平明显升高,诱发细胞功能障碍。本研究发现相比模型组,圣草次苷中剂量组和圣草次苷高剂量组TNF-α、IL-6、iNOS、MDA、LDH、GSH水平显著降低,IL-10、SOD水平显著升高,圣草次苷低剂量组均无显著变化。说明使用圣草次苷可以有效降低PD小鼠氧化应激同时降低炎症反应,但当剂量低于16 mg/(kg·d)时无显著效果。鲍琛等[17]研究表明:降低氧化应激反应和炎症反应可以有效治疗PD,与本研究得出的结论一致。

Nrf2/HO-1抗氧化反应元件通路是一种可以发挥内源性抗氧化作用来拮抗氧化应激损伤[18]。在PD 患者黑质多巴胺神经元中Nrf2 多数已经核转位至细胞核内,表达Nrf2可以减轻6-OHDA 对多巴胺神经元损伤保护神经细胞,本研究发现,相比模型组,使用圣草次苷处理各组小鼠脑组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平显著升高。说明圣草次苷可以激活Nrf2/HO-1通路,促进HO-1、NQO1蛋白表达和多巴胺竞争多巴胺转运体进入纹状体-黑质多巴胺能神经元,发生氧化应激反应增强细胞解毒进程和抗氧化能力。赵贝贝等[19]研究表明:激活Nrf2/HO-1可以增强小鼠的抗氧化能力治疗PD,与本研究得出的结论相一致。

综上所述,圣草次苷可以通过抑制氧化应激、炎症反应,神经细胞的凋亡并激活Nrf2/HO-1信号通路缓解MPTP诱导的慢性PD。但本次实验所涉及的样本量较少,在后续实验中将进一步扩大样本量进行分析。

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