不同雷公藤制剂对类风湿关节炎贫血患者的疗效及其机制①

孙艳秋 刘 健 黄 旦 文建庭 张 颖 (安徽中医药大学研究生院，合肥 230038)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种不明原因的自身免疫性疾病，以慢性、对称性、进行性多关节炎为主要表现，以滑膜炎、血管翳形成为其重要的致残病理基础[1-3]，严重影响患者的生存质量。贫血为RA中最常见的关节外症状之一，文献报道发生率在30%～60%不等；合并严重贫血是加重患者全身症状及关节功能障碍、影响预后的重要因素[4]。中药雷公藤被广泛地用在RA等风湿病的治疗中，雷公藤多苷片是临床常用的雷公藤制剂，作为我国较早研发使用的抗炎、免疫调节药物，在临床治疗RA疗效确切。复方雷公藤制剂新风胶囊为我院院内制剂，临床应用20余年，文献显示，新风胶囊能够通过显著升高血清 EPO、改善铁代谢(升高SI、TF,降低SF)、调节体内细胞因子群的平衡(降低致炎性细胞因子IL-1、TNF-α，升高抑炎细胞因子IL-10),以及上调 CD4+CD25+CD127loTreg的表达水平、调节免疫，进而减轻 RA疾病对造血功能产生的抑制[5，6],保护血细胞，在治疗RA原发病的同时又改善贫血,减轻患者的病痛。铁调素(Hepcidin,Hepc)作为调节铁代谢的负性关键因素，在较多研究中发现其表达量改变参与RA患者机体贫血过程。本研究观察不同雷公藤制剂：雷公藤多苷片、新风胶囊治疗RA贫血的疗效及Hepc相关信号传导通路的影响，并探讨其初步作用机制。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1诊断标准 诊断依据参考2010年美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)共同提出的RA分类标准[7]。贫血诊断标准参考1972年WHO制订标准：海平面地区成年男性<130 g/L，成年女性<120 g/L。轻度贫血男：90 g/L≤Hb<130 g/L，女：90 g/L≤Hb<120 g/L；中度贫血60 g/L≤Hb<90 g/L；重度贫血30 g/L≤Hb<60 g/L；极重度贫血Hb<30 g/L。

1.1.2纳入及排除标准 所有纳入患者符合RA、贫血诊断标准；Hb在60～100 g/L的患者；排除合并其他自身免疫性疾病、原发或继发血液系统疾病患者，以及未成年、妊娠、哺乳期、月经过多及精神疾病患者。

1.1.3研究对象 50例类风湿关节炎贫血患者来自2018年8月至2019年5月就诊于安徽省中医院风湿科患者。其中男12例，女38例，年龄37～72岁，平均年龄(52.86±9.14)岁；病程3.5～12年，平均(7.13±2.14)年。按照随机数字表法分为新风胶囊组(XFC组)与雷公藤多苷片组(TPT组)各25例，要求两组在年龄、性别等方面比较，差异无统计学意义，具有可比性。健康志愿者25例，作为健康对照组，均来自安徽省中医院体检中心，经检查排除自身免疫性疾病及其他器质性疾病者。要求健康对照组在年龄、性别一般基线方面，与治疗组差异无统计学意义，具有可比性。本实验纳入研究对象均签署知情同意书，并通过安徽省中医院医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1治疗方案 治疗组予以复方雷公藤制剂新风胶囊(Xinfeng Capsule,XFC)，由安徽省中医院制剂中心生产，皖药制字号：皖药制Z20050062，规格：0.4 g/粒，组方：雷公藤、蜈蚣、黄芪、薏苡仁；每粒胶囊含生药浸出物 0.4 g。服用方法：口服，每日3次，每次3粒。对照组雷公藤多苷片(Tripterygium,TPT)，福建汇天生物药业有限公司，国药准字Z35020431，规格10 mg/粒，每日3次，每次3片。连服1个月。两组患者在治疗前均未使用纠正贫血药物及输血治疗；两组患者在治疗期间均停用其他治疗RA的慢作用抗风湿药及糖皮质激素，可继续维持使用非甾体类抗炎药物。

1.2.2指标检测 研究者于空腹采集外周静脉血5 ml，4℃至自然凝固后3 000 r/min离心5 min，分离血清，应用ELISA法检测血清转铁蛋白(TRF)、铁调素(Hepc)、重组人骨形态发生蛋白6(BMP6)、SMAD4蛋白(SMAD4)、JAK激酶2(JAK2)、信号转导子及转录激活子3(STAT3)(ELISA试剂盒由武汉基因美科技有限公司提供)，应用比色法测定血清铁(SI)、总铁结合力(TIBC)(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)；红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hb)采用血球仪SYSMEX XE2100测定；RBC、Hb由安徽省中医院检验中心检测。

2 结果

2.1RA贫血患者相关指标变化

2.1.1RA贫血患者血常规指标、炎症指标情况 与正常对照组相比，RA患者RBC、Hb、CRP、ESR、IL-6、TNF-ɑ均升高，IL-4、IL-10均下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.1.2RA贫血患者铁代谢指标情况 与正常组相比，RA组铁代谢指标SI、TIBC水平明显降低，TRF、Hepc、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。

2.2XFC、TPT组患者血常规指标、炎症指标、铁代谢及相关信号通路指标的变化

IndexNC group(n=25)RA group(n=50)RBC(109 L-1)M:4.64±0.73M:3.87±0.541)F:4.26±0.40F:3.59±0.211)Hb(g/L)M:143.62±7.69M:95.35±5.481)F:127.85±6.33F:90.78±4.071)CRP(mg/dl)1.66±1.5359.28±64.581)ESR(mm/h)M:4.14±3.02M:62.23±33.821)F:8.29±5.66F:70.96±39.901)IL-4(ng/L)97.65±8.1441.04±7.731)IL-6(ng/L)25.35±2.89112.62±14.331)IL-10(ng/L)115.37±14.5046.45±10.151)TNF-ɑ(ng/L)112.12±5.25318.00±34.451)

Note：M.Male;F.Female;compared with NC group，1)P<0.01.

2.2.1XFC、TPT组患者血常规指标、炎症指标及炎症细胞因子指标的情况 与本组治疗前相比，两组患者治疗后RBC、Hb、IL-4、IL-10均升高，CRP、ESR、IL-6、TNF-ɑ均下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。两组相比，XFC组在升高RBC、Hb、IL-4方面，降低TNF-α方面优于TPT组(P<0.05或P<0.01)，而TPT组在降低CRP、ESR，升高IL-10方面，优于XFC组(P<0.05或P<0.01)。两组降低IL-6方面，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.2.2XFC、TPT组患者铁代谢指标、Hepc相关信号通路指标比较 对治疗前相比，两组患者治疗后SI、TIBC均升高，Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、 JAK2、STAT3均下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。并且XFC组在升高SI方面，降低TRF、Hepc、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3方面，优于TPT组(P<0.05或P<0.01)；两组在升高TIBC、降低IL-6方面，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

IndexNC group(n=25)RA group(n=50)Hepc(ng/L)217.24±14.48883.34±109.251)SI(μmol/L)34.71±1.9016.49±3.861)TRF(ng/L)6.87±0.6446.31±3.881)TIBC(μmol/L)74.41±1.4453.55±2.051)BMP6(ng/L)22.03±1.73466.66±82.581)SMAD4(ng/L)135.73±12.27417.14±74.101)JAK2(ng/L)163.05±8.42422.27±35.971)STAT3(ng/L)36.05±3.12120.41±22.511)

Note：Compared with NC group，1)P<0.01.

IndexXFC group(n=25)Before treatmentAfter treatmentTPT group(n=25)Before treatmentAfter treatmentRBC(109 L-1)M:3.86±0.43M:4.05±0.411)M:3.87±0.65M:3.92±0.421)2)F:3.60±0.24F:3.76±0.251)F:3.58±0.18F:3.64±0.171)2)Hb(g/L)M:96.33±5.78M:110.51±16.551)M:94.37±5.18M:102.52±11.311)2)F:89.68±4.03F:105.52±4.341)F:91.88±4.11F:98.75±4.271)3)CRP(mg/dl)59.28±44.5850.18±24.511)61.33±33.4940.66±17.361)3)ESR(mm/h)M:58.48±39.82M:49.42±17.331)M:65.98±27.82M:39.66±13.241)3)F:72.50±38.21F:50.84±23.771)F:69.42±41.59F:43.64±20.161)3)IL-4(ng/L)40.81±10.7557.75±16.691)41.27±2.5555.43±3.311)2)IL-6(ng/L)109.78±18.0251.62±7.561)112.62±14.3354.57±7.631)IL-10(ng/L)50.59±11.8753.25±20.321)46.45±10.1557.87±15.511)2)TNF-ɑ(ng/L)326.00±39.68129.10±19.961)310.01±26.76174.09±10.951)2)

Note：M.Male;F.Female;compared with before treatment,1)P<0.01；compared with XFC group,2)P<0.05,3)P<0.01.

表4 XFC、TPT组患者铁代谢指标、Hepc相关信号通路指标比较

Tab.4 Comparison of iron metabolism indicators and Hepc-related signaling pathway indicators in XFC and TPT patients

IndexXFC group(n=25)Before treatmentAfter treatmentTPT group(n=25)Before treatmentAfter treatmentSI(μmol/L)15.27±2.9626.28±1.831)16.49±3.8626.90±2.091)2)TRF(ng/L)45.50±3.6817.32±6.931)46.31±3.8819.61±5.461)2)TIBC(μmol/L)54.41±1.5165.60±1.291)53.55±2.0564.77±2.141) Hepc(ng/L)844.79±127.53340.22±60.761)921.87±70.76466.86±210.651)3)BMP6(ng/L)438.42±102.27194.33±26.691)494.90±42.46227.78±14.811)3)SMAD4(ng/L)389.67±94.69166.85±28.431)444.60±25.91226.16±20.061)3)JAK2(ng/L)416.52±49.35214.42±22.391)428.02±11.70242.73±14.951)3)STAT3(ng/L)118.51±30.6150.87±8.911)122.32±9.4863.95±4.691)3)

Note：Compared with before treatment,1)P<0.01；compared with XFC group,2)P<0.05,3)P<0.01.

3 讨论

RA贫血中以慢性病贫血为最常见的类型，占60%～80%，常伴有血液指标中单核-巨噬细胞铁沉着，血清铁和总铁结合力均显著降低，以及血清铁蛋白含量增加[8，9]。Hepc作为调节铁代谢关键因素，在较多研究中发现其表达量改变参与机体贫血过程。RA活动时免疫细胞、炎症因子损伤关节的同时干扰正常造血过程，具体包括直接抑制骨髓红系造血代偿、抑制肾脏促红细胞生成素合成、缩短红细胞寿命、干扰铁代谢等方面[10]。既往研究表明，炎症细胞因子及通路、补体系统、免疫球蛋白等对RA病程发展起重要作用[11]。TNF-α、IL-6等促炎因子浸润于RA关节滑膜组织，对滑膜组织增生、巨噬细胞激活等起重要作用。IL-4、IL-10可抑制促炎因子分泌、发挥下调炎症反应的作用，对RA患者组织起保护性[12]。ESR、CRP、RF等指标常常用于判断风湿性疾病活动期，对评估疾病的进展、预后方面有重要意义。Hepc是RA贫血患者铁代谢重要的负性调控者，而BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3信号通路为调节Hepc介导贫血的主要信号通路，且两条信号通路的表达存在相互影响，共同作用促进Hepc分泌。研究表明，通过敲除小鼠的 SMAD4 基因，不仅使Hepc的表达急剧减少，而且发现小鼠Hepc的表达在 BMP/SMAD 通路不完整的情况下不受炎症因子IL-6的影响[13]。本研究通过与正常对照组对比发现，RA组RBC、Hb、SI、TIBC、IL-4、IL-10水平明显降低，CRP、ESR、TRF、Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明显升高，表明RA贫血患者体内存在高水平的炎症反应、促炎与抑炎细胞因子网络失衡、铁代谢紊乱，及BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3介导的Hepc相关信号通路的异常活化。

中药雷公藤被广泛应用于风湿病的治疗，具有“祛风除湿、活血通络、消肿止痛”的功效；雷公藤功效最早记录于《滇南本草》，记载其“味辛，性温，有毒。入肝脾十二经，行十二经络”，具有“治筋骨疼痛，风寒湿痹，瘫痪痿软，湿气流痰”等功效。现代研究表明雷公藤具有抑制增殖、抗炎、调节免疫、抗癌等作用[14,15]。雷公藤多苷片是经中药雷公藤减毒后制成的雷公藤制剂，作为我国较早研发使用的抗炎、免疫调节药物，在临床治疗RA疗效确切。复方雷公藤制剂新风胶囊由雷公藤、蜈蚣、黄芪、薏苡仁4味药通过配伍组成，应用于临床20余年，文献表明其具有良好的调节免疫、抗炎镇痛、稳定红细胞膜、增加微循环灌注等作用，能够改善细胞代谢和促进功能恢复等[16]；刘健等[17]通过研究发现：处于疾病活动期的RA贫血的患者的外周血中，表现为CD4+CD25+CD127loTreg水平的降低。经XFC干预后 CD4+CD25+Treg、Foxp3、CD4等蛋白的表达升高，5-HT、CORT、TNF-α表达降低，调节 Notch 信号传导通有关。本研究发现TPT组、XFC组患者：经不同雷公藤制剂TPT、XFC治疗后，两组患者与治疗前相比，RBC、Hb、SI、TIBC、IL-4、IL-10均升高，CRP、ESR、TRF、Hepc、IL-6、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3明显下降。表明以上两种不同雷公藤制剂均能够改善RA患者的贫血状态，降低炎症反应，调节机体铁代谢，降低Hepc信号通路的活化。而通过TPT组、XFC组的对比发现，XFC组在升高RBC、Hb、SI、IL-4方面，降低TRF、Hepc、TNF-α、BMP6、SMAD4、JAK2、STAT3方面，优于TPT组；表明XFC在改善患者贫血、调节铁代谢方面，疗效优于TPT。

综上，雷公藤多苷片、新风胶囊两种不同雷公藤制剂，均能够改善患者的贫血状态，与降低RA患者机体炎症反应、调节铁代谢，降低Hepc相关的BMP6/SMAD4、JAK2/STAT3信号通路的活化有关。并且新风胶囊在升高血红蛋白、调节铁代谢，降低Hepc相关信号通路活化方面，优于雷公藤多苷片，其具体分子学机制，尚需进一步实验验证。