番茄红素抗哮喘作用及机制研究①

金炳熔 车 楠 李良昌 李 莉 (延边大学医学院解剖教研室，延吉 133002)

哮喘是一种涉及免疫、环境、遗传等多种因素的慢性肺部疾病，已成为全球儿童和成人临床医学中最常见的疾病之一[1]。哮喘的特点是气道炎症，气道高反应性(airway hyperresponsiveness,AHR)和可逆性气流阻塞。气道炎症通常由免疫细胞过度活化引起，以嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞增生、黏液分泌为特征。气道炎症过程中，活化的炎症细胞分泌细胞毒性介质导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生。当机体内ROS水平过高时可诱发气道氧化应激，无差别损伤细胞内功能生物分子并调控细胞信号的转导，诱导肥大细胞脱颗粒、气道重塑和黏液分泌促进气道损伤，导致哮喘进一步加重[2]。因此，抑制ROS可能是哮喘的潜在治疗靶点。番茄红素(Lycopene,LYC)广泛存在于自然界的各种水果和植物中，具有免疫调节作用并能够通过抑制氧化应激在LPS诱导的小鼠肺损伤中发挥抗炎作用[3，4]。目前，番茄红素对哮喘的作用及机制尚未有明确研究。因此，本研究以卵清蛋白(OVA)建立小鼠哮喘模型，并给予番茄红素治疗，探讨番茄红素对哮喘的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料 番茄红素、OVA(美国Sigma公司)；活性氧检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒(碧云天)；IL-4、IL-5和IL-13 ELISA试剂盒、IL-5(MM550CB)和IL-13(M130B)抗体(美国Invitrogen公司)；IL-4(12227)、p-PI3K(4228)、PI3K(4255)、p-AKT(9275)、AKT(9272)，p-NF-κB p65(3033)、NF-κB p65(6956)和β-actin(4970)抗体(美国Cell Signaling公司)；402型雾化器(四菱医疗器械厂)；气压体积描记室(韩国All Medicus公司)；酶标仪(Bio Rad，美国)；流式细胞仪(美国贝克曼公司)；电泳仪及电泳槽(美国Bio Rad公司)；Cytation5多功能成像(美国Bio Tek公司)；Amersham Imager 600凝胶成像系统(美国GE Healthcare)。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立与分组 小鼠随机分为对照组(control)、模型组(model)、番茄红素低剂量组(LYC 50 mg/kg)和番茄红素高剂量组(LYC 100 mg/kg)。模型组、番茄红素组小鼠于第1、7、14天腹腔注射OVA(10 μg)+氢氧化铝(1 mg)的生理盐水混合液200 μl，对照组注射等量生理盐水。第21天将致敏小鼠置于玻璃罩内，每组以OVA(0.1 g)生理盐水混合液10 ml雾化吸入30 min，1次/d，共7 d。治疗组在激发前分别灌服番茄红素50 mg/kg或100 mg/kg，共计7 d。

1.2.2实验样本获取与处理 将小鼠于末次激发48 h后麻醉致死，以1 ml生理盐水进行支气管肺泡灌洗，收集BALF，血球计数仪计细胞总数。剩余BALF在4℃，1 000 r/min离心5 min，取上清液，-80℃保存，待测细胞因子。离心沉淀涂片后Diff-quik染色，进行细胞分类计数。取右肺下叶，10%(v/v)甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，HE染色观察肺部炎症情况。其余各肺叶放入液氮中速冻，-80℃保存待用。

1.2.3BALF中细胞因子IL-4、IL-5和IL-13含量的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体操作按试剂盒说明书进行，结果单位以pg/L表示。

1.2.4BALF和肺组织中ROS的检测 BALF离心涂片，500 mg右肺组织样品制备匀浆(10%，w/v)，按照说明书装载DCFH-DA探针，cytation5成像系统或流式细胞仪488 nm激发波长，525 nm发射波长条件下进行检测。

1.2.5ROS、MDA和SOD的检测 取500 mg右肺组织样品制备匀浆(10%，w/v)。根据试剂盒说明书进行操作，测定ROS、MDA水平以及SOD活性。

1.2.6Western blot分析 肺组织制备匀浆，裂解后获取蛋白，BCA方法测定蛋白浓度，每泳道加入20 μg 样本，进行电泳及转膜，50 g/L脱脂奶粉TBS-T缓冲液孵育封闭膜上非特异性位点，按照抗体比例进行稀释后孵育2 h。洗膜后再用HRP标记的二抗杂交，室温孵育2 h。清洗后加入ECL发光试剂，利用Amersham Imager 600凝胶成像系统成像并分析。

1.2.7气道高反应性(AHR)检测 最后一次OVA激发后48 h，将清醒的大鼠置于体描室，记录3 min内平均基线读数，采用乙酰甲胆碱(从2.5至50 mg/ml)进行雾化3 min，记录平均读数。根据制造商的方案计算增强呼气间歇(Penh)，作为气道缩窄指数来反映气道高反应的程度。

2 结果

2.1番茄红素对哮喘小鼠BALF中细胞总数及各分类细胞数的影响 如表1所示，模型组小鼠BALF中细胞总数明显高于对照组，且嗜酸性粒细胞，中性粒细胞和淋巴细胞数均显著升高(P<0.05)；番茄红素灌胃治疗后，哮喘小鼠BALF中各项指标明显下降(P<0.05)。

2.2番茄红素对哮喘小鼠肺部炎症的影响 观察哮喘小鼠肺部炎症变化，HE染色结果显示，模型组存在明显的气道平滑肌增厚，黏液分泌过多以及大量的炎性细胞浸润。而番茄红素治疗组小鼠肺组织气道上皮无明显增厚，肺泡壁较完整，炎性细胞明显减少。

GroupsTotal cells(×104/ml)Lymphocytes(×104/ml)Neutrophils(×104/ml)Eosinophils(×104/ml)Control8.35±0.970.37±0.080.54±0.061.06±0.20Model24.88±3.011)3.45±0.841)2.07±0.411)13.42±2.461)LYC 50 mg/kg18.26±2.832)2.69±0.122)1.48±0.222)9.27±1.312)LYC 100 mg/kg12.44±1.072)1.97±0.262)1.06±0.092)6.55±0.722)

Note：Compare with control,1)P<0.05;compare with model,2)P<0.05.

2.3梓醇对BALF和肺组织中IL-4、IL-5和IL-13水平的影响 如表2所示，ELISA结果表明，与正常对照组比较，模型组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平明显增高(P<0.05)；番茄红素明显降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平(P<0.05)。与Western blot结果一致(图2)。

图1 番茄红素对哮喘小鼠肺部炎症的影响(×200)

GroupsIL-4(pg/ml)IL-5(pg/ml)IL-13(pg/ml)Control76.51±10.0768.37±11.9652.24±9.33Model402.71±40.661)377.45±38.62195.76±32.981)LYC 50 mg/kg295.10±37.432)264.39±40.092)127.55±14.312)LYC 100 mg/kg147.39±19.642)128.92±20.062)84.18±10.882)

Note：Compared with control,1)P<0.05;compared with model,2)P<0.05.

图2 番茄红素对哮喘小鼠肺组织中IL-4、IL-5和IL-13表达的影响

2.4番茄红素对哮喘小鼠AHR的影响 如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠气道反应明显增高(P<0.05)；而番茄红素能够抑制哮喘小鼠的气道高反应(均P<0.05)。

2.5番茄红素对哮喘小鼠肺部氧化应激的影响 如图4所示，模型组小鼠肺部ROS和MDA水平明显升高，而抗氧化酶SOD活性明显下降(P<0.05)；番茄红素能够有效降低哮喘小鼠肺部ROS和MDA水平并提高SOD活性(P<0.05)。

2.6番茄红素对PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响 如图5所示，模型组p-PI3K、 p-AKT以及p-p65表达水平明显升高(P<0.05)，而番茄红素和NAC处理后，蛋白表达明显降低(P<0.05)。

图3 番茄红素对哮喘小鼠AHR的影响

图4 番茄红素对哮喘小鼠肺部氧化应激的影响

图5 番茄红素对PI3K/AKT/NF-κB的影响

3 讨论

哮喘是一种复杂的临床综合征，以炎症、气道高反应性和重塑为特征，与活性氧生成增加和抗氧化防御功能受损有关[5]，是全球范围内最常见的过敏性疾病之一。研究表明[6]，哮喘主要由适应性免疫介导，其中Th2型细胞因子具有重要作用，Th2细胞迁移到气道上皮细胞后分泌2型细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等，参与黏液分泌，气道重塑和AHR。番茄红素是一种重要的红色非氧类胡萝卜素，以往对其生物学功能的研究主要集中在抗氧化、降低心血管疾病的风险、减少基因损伤和抑制肿瘤生长等[7]，而针对哮喘方面的作用尚未有明确报道。本研究实验结果表明，番茄红素能够抑制哮喘小鼠BALF中炎症细胞浸润，降低BALF和肺组织中IL-4、IL-5和IL-13水平，改善肺组织病理学，抑制气道高反应性，表明番茄红素具有抗哮喘作用。

氧化应激是诱导细胞内重要生物分子和亚细胞结构损伤的多种细胞通路的基础，由ROS等多种活性物质共同参与。ROS是一组不稳定的、具有高度活性的分子或自由基，在免疫、细胞生长和细胞信号传导中发挥重要作用。哮喘进程中，气道中浸润炎症细胞以及气道结构细胞会产生大量的ROS，高水平的ROS加剧了气道对过敏原激发的反应，并对气道功能造成了许多不利影响，包括气道平滑肌收缩，AHR诱导，黏液分泌过多，上皮脱落和血管渗出[8-10]。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)是氧化应激的一种生物标志物，能够提示细胞脂质过氧化的水平。以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)为主的一线防御抗氧化剂能够破坏超氧自由基，在机体抗氧化防御系统中是必不可少的。本研究发现，番茄红素处理后，哮喘小鼠肺部ROS水平、MDA水平明显下降，SOD活性明显提高，表明番茄红素处理后能够明显抑制哮喘小鼠肺部氧化应激。

ROS是调节细胞活动的关键信号转导分子，能够参与多种细胞信号传导途径的调控。Phospho-inositide 3-kinase/protein kinase B(PI3K/AKT)信号通路是参与外部刺激反应的重要细胞级联。PI3K激活下游信号分子AKT，并在多种生物反应中发挥重要作用，包括炎症、细胞增殖和细胞凋亡等[11]。研究表明，ROS能够激活PI3K/AKT信号通路，促进转录因子，如核转录因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)的激活[12]。NF-κB属于诱导核转录因子家族，能够调节炎症反应，除了协调先天免疫细胞中各种促炎基因的诱导，NF-κB还能调节炎症T细胞的活化、分化和效应功能，诱导IL-4等促炎细胞因子表达[13,14]，导致气道纤维化，平滑肌细胞增殖以及肺部黏液量增加，进一步加重哮喘。本研究结果表明，番茄红素能够抑制哮喘小鼠肺部p-PI3K、p-AKT以及p-p65表达。暗示番茄红素可能通过调控ROS抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路。综上所述，本研究表明，番茄红素可能通过抑制ROS调控的PI3K/AKT/NF-κB通路发挥其抗哮喘作用。