养阴益气活血方对干燥综合征NOD小鼠颌下腺BCL-6和CXCR5表达的影响①

王 庆 李天一 吴国琳 卢雯雯 陈 玖

(浙江省立同德医院，杭州 310012)

干燥综合征(sjogren′s syndrome，SS)是一种以高度淋巴细胞浸润为特征的常见风湿免疫性疾病，以侵犯泪腺、唾液腺等外分泌腺体为主。临床表现以眼干、口干为最多见，其他部位如肺、肝、胰腺、肾脏及血液系统、神经系统等也可被累及。SS发病有严重的女性倾向，女性与男性的患病比率高至(9～20)∶1，平均发病年龄通常在40～50岁[1]。

SS病因及发病机制尚未完全明确。近年的研究逐渐认识到Tfh细胞对自身免疫性疾病的影响，其相关分子在免疫应答中起重要作用[2]，有实验证明Tfh细胞可能与原发性干燥综合征的严重程度密切相关[3]，对外分泌腺中生发中心的形成和维持至关重要[4]。Tfh细胞参与B细胞激活，此功能来源于Tfh-B淋巴细胞的表面相互作用，Tfh细胞分泌的CXCR5是参与B细胞激活的关键细胞因子[5]，而BCL-6是Tfh的特异性转录因子，研究显示干燥综合征病人的Tfh细胞有明显升高的BCL-6表达[6]。

目前，干燥综合征尚无特效治疗方法，西医主要采用替代和对症治疗[7]，而中医药治疗SS有明显优势。课题组前期研究表明养阴益气活血方对SS疗效确切，不仅能改善临床症状，还能提高患者的生活质量，它能通过调节Th1/Th2的免疫平衡、Fas/FasL、AQP-5及其mRNA、TNF-α、IL-1β等的表达起作用[8,9]。因此，在前期研究基础上，探讨Tfh细胞相关分子BCL-6、 CXCR5与干燥综合征的相关性，从对Tfh细胞相关分子BCL-6、 CXCR5的调节角度阐释中药养阴益气活血方治疗SS的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 NOD小鼠30只，雌性8周龄，体重(21.822±0.814)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司(动物合格证号：20130016000707)，饲养于浙江中医药大学SPF级动物室(温度25℃，湿度46%RH)。

1.1.2主要试剂 兔抗鼠BCL-6单克隆抗体[EPR11410-43]ab172610、兔抗鼠CXCR5多克隆抗体ab203212，均由abcam公司生产。

1.1.3实验用药 养阴益气活血方：太子参15 g，五味子9 g，山茱萸15 g，女贞子15 g，红景天15 g，肿节风10 g，丹参15 g，白芍10 g，黄精10 g，山药30 g，乌梅6 g，由浙江大学医学院附属第一医院中药房提供，在浙江中医药大学实验室煎煮、浓缩成含生药2.25 g/ml的药液。

硫酸羟氯喹片:0.1 g/片，由上海上药中西制药有限公司生产，批号:H19990263.用蒸馏水稀释成含生药量3 mg/ml的混悬液。

1.2方法

1.2.1实验分组与给药 将30只NOD小鼠随机分为4组，即：模型组(Model group)6只(灌服去离子水0.4 ml)，中药组(TCM group)8只(灌服中药养阴益气活血煎剂0.4 ml)，西药组(WM group)8只(灌服羟氯喹0.4 ml)，结合组(ITCWM group)8只(灌服养阴益气活血煎剂和羟氯喹0.4 ml)。各组小鼠自由进食，饮水。适应性饲养一周后，各给药组小鼠每日灌胃、给药、饲养8周。

1.2.2取材与材料处理 灌胃8周后，处死小鼠，解剖摘取双侧颌下腺并称重，将颌下腺置于4%多聚甲醛中固定后，经流水过夜置于自动脱水机中脱水。然后进行浸蜡包埋，自然冷却后放入4℃冰箱中保存，用切片机进行连续冠状切片，片厚5 μm，置于41℃蒸馏水后拣出、烘烤，常温保存备用。

1.2.3观察指标及方法

1.2.3.1小鼠一般情况观察 每天观察各组小鼠的皮毛、色泽、活动量、尾部瘀斑、粪便等情况。每3 d 记录小鼠的饮水量。

1.2.3.2颌下腺指数 颌下腺指数=双侧颌下腺重量(mg)/小鼠体重(g)。

1.2.3.3颌下腺病理形态观察及评价 将颌下腺置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下成像并扫描成电子图片观察其组织形态，根据Chisholm-Mason组织学评分方法将各组小鼠颌下腺病变轻重程度进行量化分析，评价标准见表1。

1.2.4颌下腺组织BCL-6、CXCR5的表达 采用免疫组化法检测各小鼠颌下腺组织BCL-6、CXCR5的表达，按照试剂盒说明书严格操作。

2 结果

2.1各组小鼠一般情况 在饲养过程中西药组有1只小鼠死亡，解剖后发现食道损伤，推测是因为灌胃操作损伤引起死亡。各组NOD小鼠中均存在不同程度、不同部位脱毛现象且逐渐加重，尾部逐渐出现少量瘀点或瘀斑，模型组脱毛现象尤其严重；其次NOD小鼠除个别精神萎靡倦怠嗜睡外，大多精神状态可。

表1 SS模型小鼠颌下腺病理学评价标准

Tab.1 Evaluation criteria of submandibular gland pathology in SS model mice

ScoreGradePathological grading standard00Minimal lymphocyte infiltration11A small amount of scattered lymphocyte infiltration22Moderate lymphocyte infiltration(not focal)with mild parenchymal damage330-1 lymphocyte infiltrating foci/5 low-power fields with moderate parenchyma damage442-3 lymphocyte infiltration foci/5 low-power fields with severe parenchyma lesions

Note:A single focal center is a collection of 50 or more lymphocytes,plasma cells,or histiocytes.

图1 平均每只小鼠每三天的饮水量

表2 各组小鼠的平均颌下腺指数比较

Tab.2 Mean submandibular gland index of each group

GroupNumberMean submandibulargland mass(mg)Submandibulargland index(mg/g)Model group697.03.67±0.75TCM group899.33.92±0.61WM group782.83.44±0.621)ITCWM group8100.44.25±0.47

Note:Compared to the combined group，1)P<0.05.

2.2各组小鼠的饮水量比较 从折线图可以看出模型组小鼠饮水量明显高于其他各组且呈明显的上升趋势，各用药组除结合组较平稳外，其余各组均有不同程度的上升趋势，上升程度由高到低依次是模型组、中药组、西药组、结合组(见图1)。

2.3各组小鼠颌下腺指数比较 见表2。

2.4各组小鼠颌下腺组织病理形态观察 光镜下颌下腺病理观察显示，模型组颌下腺可见间质中有大量淋巴细胞浸润，形成多个淋巴细胞浸润灶，腺泡大小不等，腺体萎缩，部分有破坏，以导管周围为明显。给药组小鼠颌下腺病理形态学观察可见程度不等的淋巴细胞浸润灶和间质散在的单个淋巴细胞浸润，腺泡大小不等，偶见有少量导管和腺泡结构破坏(见图2)。

图2 各组小鼠颌下腺病理观察

图3 颌下腺组织病理评分非参数秩和检验

图4 各组颌下腺组织BCL-6蛋白颗粒的表达

图5 各组小鼠颌下腺CXCR5蛋白颗粒的表达

表3 各组小鼠颌下腺BCL-6、CXCR5的平均光密度

Tab.3 Average optical density of submandibular gland BCL-6 and CXCR5 in each group

GroupsNumberAverage optical density(x±s)BCL-6CXCR5Model group60.074±0.01 0.219±0.014TCM group8 0.069±0.0072)3)0.213±0.011)WM group70.073±0.0090.214±0.02ITCWM group8 0.07±0.0052)3) 0.212±0.0131)

Note:Compared to the model group，1)P<0.05；compared to the model group，2)P<0.01；compared to the western medicine group，3)P<0.01.

2.5各组小鼠颌下腺组织病理评分比较 各组小鼠颌下腺组织病理评分比较显示，结合组显著低于模型组(P<0.05)，其他组之间无显著差异，但在中位数上结合组和中药组低于模型组和西药组(见图3)。

2.6各组小鼠颌下腺组织BCL-6、CXCR5的表达

2.6.1小鼠颌下腺组织BCL-6、CXCR5免疫组化表达(见图4、5) BCL-6蛋白颗粒主要表达于淋巴细胞灶中,分布于淋巴细胞细胞核上，CXCR5蛋白颗粒也主要表达于淋巴细胞灶中，分布于淋巴细胞的细胞浆和细胞膜上，亦有少数阳性淋巴细胞散在分布于间质，模型组呈棕褐色或棕黄色的强阳性反应，用药组呈棕褐色—淡黄色的阳性反应，结合组的阳性反应明显偏弱。

2.6.2各组小鼠颌下腺组织BCL-6和CXCR5的表达的平均光密度比较(见表3) 从表中看出，BCL-6平均光密度中药组和结合组明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；同时中药组和结合组显著低于西药组(P<0.01)。CXCR5平均光密度中药组和结合组低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

原发性干燥综合征(primary sjogren′s syndrome,pSS)因其B淋巴细胞高反应性和多克隆免疫球蛋白的产生被认为是一种自身免疫病，在病理上以淋巴细胞浸润的生发中心为主要表现，其内大多数为CD4+T 细胞，也有CD8+T 细胞，B细胞、浆细胞、树突状细胞和巨噬细胞[10]。滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells,Tfh)高表达趋化因子受体CXCR5，在适当的条件下被趋化至外周淋巴组织滤泡中，是一种CD4+效应T细胞，辅助B细胞进行体液免疫[11]。其基本功能特征为在生发中心滤泡内辅助 B 细胞增殖分化出浆细胞和记忆细胞，产生大量免疫球蛋白以及多克隆抗体，并且也显著影响抗体亲和力成熟、高频突变、类别转换等过程，因此对生发中心的形成至关重要[12]。有临床研究[13]表明Tfh细胞比例在明显病程阶段的pSS病人是升高的，而且升高的Tfh细胞比例与某些B细胞亚型比例和自身抗体水平有很明确的相关性，即Tfh细胞也许对SS疾病发展起重要作用，因此调节Tfh细胞相关分子可以成为治疗pSS的新靶点。BCL-6是序列特异性的转录抑制子，主要表达于CXCR5hi的Tfh，是CXCR5等Tfh表面标志物表达的自变量且与之成正相关，并且是Tfh分化的必要充分条件[14]，因此被称为Tfh的特异性转录因子[15]。CXCR5为Tfh细胞的重要表面标志物，是Tfh细胞迁移、定位到生发中心的趋化因子受体[12]。

NOD小鼠是较公认的研究SS的实验动物，有研究在NOD小鼠的外分泌腺中检测到淋巴细胞浸润以及由此发展而来的涎腺炎和泪腺炎，同时也检测到NOD小鼠和SS病人一样的信号自身抗体包括ANA、anti-SSA/Ro、anti-SSB/La、120-kDaa-fodrin抗体和anti-M3R自身抗体等[16,17]。因此，NOD鼠被广泛应用于SS实验研究。

中医古籍中无干燥综合征病名，但与本病相关的论述，可散见于各医著中，属于“燥证”、“痹证”等范畴。《素问·阴阳应象大论》篇有“燥胜则干”的记载。全国中医痹病委员会著《痹病论治学》将干燥综合征中医命名为“燥痹”，认为燥痹是由外燥或内燥诸燥邪损伤气血津液而致阴津耗损、气虚血亏，导致肢体筋脉失养，肌肉失濡；瘀血痹阻，痰凝结聚而致脉络不通；不荣则痛，不通则痛因而引起肢体疼痛，甚则肌肤枯涩、脏器损害的病症[18]。燥痹临床主要表现为口燥咽干，眼干少泪，或兼见皮肤干燥瘙痒、鼻干鼻衄、阴道黏膜干燥瘙痒等，关节酸痛，舌质红少苔、脉细，甚者吞咽困难，牙齿片状脱落成猖獗性龋齿等症状。本病顽固复杂，缠绵难愈，病程较长。

前期研究结果显示阴虚是SS最常见的证素，其次是血瘀和气虚[19]，其对应的治法则为养阴、活血、补气。我们前期的临床研究证明养阴益气活血方应用于干燥综合征患者能起到较高的治愈率，与西药联合应用时的疗效明显高于单纯西药治疗[8]。前期的动物实验证明养阴益气活血方能通过影响Th1/Th2的免疫平衡、TNF-α、IL-1β、Fas/FasL、AQP-5等分子的表达水平，改善颌下腺病理，有效阻止SS的病程进展[20-23]。

养阴益气活血方中以太子参为君，补益肺脾气阴，臣以黄精、山药益气养阴，补脾润肺益肾，辅助太子参补益之功，并白芍、五味子、山茱萸、女贞子、乌梅养血敛阴生津，滋补肝肾，佐以肿节风、红景天、丹参活血化瘀止痛。诸药合用，共达养阴生津、益气补血、活血化瘀之用。

本研究对NOD小鼠饮水量、颌下腺指数、颌下腺病理形态的检测结果证实了养阴益气活血方对干燥综合征的治疗作用，而且结合组的治疗效果最好，明显优于单纯西药治疗。同时发现养阴益气活血方可以明显降低Tfh细胞相关分子BCL-6、CXCR5的表达，而西药羟氯喹则对此分子通路无影响，因此可以推断养阴益气活血方可能通过下调Tfh细胞相关分子BCL-6、CXCR5的表达水平，较好地延缓SS的病理损害和病情进展，改善病情。其具体作用机制将在今后工作中继续深入研究。