蛹虫草对小鼠肠道菌群的影响

王思雅 徐方旭 柳叶飞 王升厚*

（1沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳110034；2沈阳师范大学实验教学中心，辽宁沈阳110034）

肠道菌群是人体肠道的正常微生物，能合成多种人体生长发育必需的维生素，如B族维生素、维生素K、烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收[1]。这些营养物质对人类健康有重要作用，一旦缺少会引起多种疾病。人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、降低感染和自身免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应[2]。其中益生菌主要包括双歧杆菌和乳酸杆菌，其有促进肠道蠕动，抑制致病菌群生长，分解有害、有毒物质等作用[3]。此外，人体肠道内也存在某些致病菌如肠球菌、大肠杆菌等，当它们大量繁殖就会引发多种疾病。

蛹虫草（Cordyceps militaris）又名北冬虫夏草，为我国传统滋补性食药用药，是虫草属的模式种[4]。硒（Se）具有抗癌、抗氧化、保护机体免受活性氧自由基损伤、保护心脏、解毒、提高免疫力、延缓衰老等多种药理作用。富硒蛹虫草通过自然生长富硒，既含有蛹虫草全精华，又能补充人体硒蛋白，价值更胜一筹[5]。贾俊杰[6]等表明，蛹虫草可以缓解小鼠肠道菌群失调的症状，但关于小鼠正常状态下饮用蛹虫草溶液对肠道菌群变化的研究较少，试验首次探讨富硒蛹虫草对小鼠肠道菌群影响，为医疗、临床研究提供依据，为新药物开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）试验小鼠：昆明小鼠59只，5～6周龄，雌29只、雄30只，18～22 g[7]。饲养于沈阳师范大学动物房。

（2）蛹虫草：沈阳师范大学实验室内普通蛹虫草、富硒蛹虫草各一种。

（3）培养基：双歧杆菌（BBL培养基）：蛋白胨15 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉2 g，可溶性淀粉0.5 g，氯化钠 5 g，L-半胱氨酸 0.5 g，番茄浸粉 5 g，肝浸粉2 g，琼脂20 g，吐温80 1 mL，pH 7.0[8]。

乳酸杆菌（MRS培养基）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7]2.0 g，葡萄糖（C6H12O6·H2O）20.0 g，吐温80 1 mL，乙酸（CH3COONa·3H2O）5.0 g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g，琼脂 18.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.0～6.5[9]。

肠球菌（胆盐－七叶苷－叠氮钠琼脂）：牛肉浸粉3 g，胰酪蛋白胨17 g，酵母粉5 g，牛胆粉10 g，氯化钠5 g，七叶苷1 g，柠檬酸铁铵0.5 g，叠氮化钠0.25 g，柠檬酸钠1 g，琼脂13.5 g，pH 7.1±0.2。

大肠杆菌（EMB培养基）：蛋白胨10 g，乳糖10 g，磷酸氢二钾2 g，琼脂25 g，2%伊红水溶液20 mL，0.5%亚甲蓝水溶液13 mL，pH 7.4。

1.2 主要仪器设备

试验主要仪器设备：台式离心机（美国Sigma）；高压灭菌锅（日本Sanyo公司）；显微镜（日本Nikon）；生物超净工作台（美国Baker公司）；恒温培养箱（江苏太仓市实验设备厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 小鼠分笼及喂养方法

表2 雌鼠分笼情况 g位

表3 雄鼠分笼情况 g位

本试验共分7组，0倍组为空白对照组，1倍组至10倍富硒组为试验组[10]，具体操作方法如下：

0倍组：灌喂生理盐水，每日灌喂20 mL/（kg·BW），灌喂21 d。

1倍组至10倍富硒组：根据60 kg成人日摄入2 g蛹虫草固体溶液换算小鼠为0.303 mg/g[11]，配制成 1倍（0.303 mg/g）、2倍（0.606 mg/g）、5倍（1.515 mg/g）、10倍（3.033 mg/g）不同质量浓度的蛹虫草溶液，每日灌喂20 mL/（kg·BW），灌喂21 d[12]。雌、雄鼠重控制在±3 g之间（表2和表3），适应性喂养一周[13]。

1.3.2 肠道菌群数量测定

1.3.2.1 小鼠肠道内容物的采集

分别在第0天、第10天和第21天早晨对小鼠称重，并采集小鼠的新鲜粪便样0.05 g于灭菌试管中。取5 mL灭菌的磷酸盐缓冲液加入粪样试管中，充分振荡混匀，成粪样匀质液，再用10倍稀释法稀释，待测[14]。

1.3.2.2 肠道菌群的培养

根据待分离菌种的活菌数，选择相应适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1 mL稀释液，用涂布棒进行平板涂布，每个稀释度3个重复，培养条件如表4[15]。

厌氧培养方法：将厌氧菌接种于相应平板上，套上聚丙烯袋，置于CO2培养箱中36℃培养。按表4方法[16]进行计数后，换算出每克肠道内容物中所含菌落数，以第0天的菌落数为对照观察各组益生菌和致病菌数量的变化情况。每克肠道内容物菌落数以1 g（CFU/g内容物）表示，计算公式如下：每克肠道内容物菌落数=1 g（菌落数×稀释倍数×每次稀释取样体积）/（接种用样品体积×样品质量）[17]。

表4 肠道菌群培养条件及鉴定方法

1.3.2.3 数据处理

试验数据经Excel进行初步处理后用SPSS软件进行统计，单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行差异显著性检验，多重比较采用最小显著差数法（LSD），结果以平均值±标准差表示[18]。

1.3.3 高通量方法测定

取靠近回盲部的小肠段，平铺于滤纸上，纵向剖开，取肠腔内成形粪便于冻存管中，置液氮中6～8 min，于-80℃保存[19]，将雄鼠样本0倍组（0 C）和普通5倍组（5 C）送上海生工生物公司检测。

2 结果与分析

2.1 肠道菌群菌落形态的鉴定

由图1可知，在同一稀释度下双歧杆菌和乳酸杆菌的数量要多于其他两种菌，且双歧杆菌菌落较小为瓷白色，显微镜下多呈X或Y型；乳酸杆菌菌落较大为微白色，显微镜下常为链状；肠球菌菌落有明显褐色圈；大肠杆菌菌落有绿色金属光泽。

图1 菌落形态的鉴定

2.2 蛹虫草溶液对小鼠生命活动的影响

图2 A、B雌雄鼠体重除10倍富硒组外均增加，且对照组增加量最大，说明灌胃不同浓度及不同品种的蛹虫草会使小鼠体重增长减慢，而10倍富硒浓度导致小鼠体重下降，可能已影响小鼠生命活动。此外，灌胃15 d后，5倍组雌性小鼠体重降低，可能是到灌胃后期小鼠口味变差，饮食饮水量都减少，因此体重下降。

图2 各组小鼠体重、日饮水及日食量变化

雌雄鼠日饮量（图2C、D）和日食量（图2E、F）除10倍富硒组外趋势相近，可认为这几组不同浓度的普通蛹虫草对小鼠饮水量和进食量没有显著影响。但雄鼠10倍富硒组可能是由于虫草浓度大，富硒营养多，导致其饮水量降低。对于雌鼠来说，灌喂后进食量大多数都比对照组增加的小，说明灌喂蛹虫草对雌鼠进食有微弱影响。

2.3 小鼠各脏器指数测定结果

表5 小鼠各脏器指数 %单

由表5可以看出，不同组各脏器指数变化不大，均到万分之一才有少量变化，且进行单因素方差分析，不存在差异显著性（P＞0.05），因而可以认为灌喂不同浓度蛹虫草对小鼠的脏器无明显影响。

2.4 蛹虫草溶液对小鼠肠道菌群的影响

表6 小鼠肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的菌量变化（X±SD）1 g（CFU/g）中

2.4.1 益生菌数量变化

统计学上，各组双歧杆菌数量，与对照组相比差异都极显著（P＜0.01）。从菌落数据来看（表6），0倍组双歧杆菌的数量随灌胃天数增加逐渐降低，小鼠经灌胃各浓度普通蛹虫草21 d后，除10倍普通组双歧杆菌量均降低外，富硒蛹虫草组双歧杆菌量增加，即10倍普通和10倍富硒组灌喂21 d后，双歧杆菌数量增加。

乳酸杆菌分析，5倍富硒组和10倍富硒组P＞0.05，即该浓度灌喂21 d后小鼠乳酸杆菌数量无明显变化。其他各组P＜0.05，差异显著；同双歧杆菌，0倍组乳酸杆菌数量逐渐降低，10倍普通组和10倍富硒组灌喂21 d后，乳酸杆菌数量比灌喂前增加，其余组菌量减少。

表7 小鼠肠道肠球菌和大肠杆菌的菌量变化（X±SD）1 g（CFU/g）中

2.4.2 致病菌数量变化

肠球菌分析，0倍组和5倍富硒组P＞0.05，即这两组灌喂21 d后对于肠球菌数量无明显影响，其他各组P＜0.01，差异都极其显著。从菌落数据分析（表7），蛹虫草浓度越高肠球菌数减少量越小。即1倍组肠球菌减少量最大，10倍组减少量最小，且10倍富硒组小鼠经灌胃21 d后肠球菌数量增加。

大肠杆菌分析，可能由于培养基配制不当，或培养环境不适宜，许多浓度组未长出菌落。10倍富硒组P＜0.05，有显著差异，灌喂21 d后大肠杆菌数量减少，说明灌喂蛹虫草对大肠杆菌数量有影响，随着灌喂时间增加菌量减少，具体是哪一浓度影响最大需要再进行后续试验。

2.5 高通量检测

根据OTU分布韦恩图（图3A）、多样性指数分析（图3B）和群落结构组分图（图3C）可看出普通5倍组OTU数目比对照0倍组多，多样性增加，且根据5种Alpha指数分析证明5倍组微生物种类增多。在相同灌喂21 d时，乳酸杆菌数量减少，与菌落计数结果相同：随着蛹虫草浓度增加，益生菌数量先减少后增加，即普通5倍组益生菌数量最小。

3 结论与讨论

雌雄鼠体重除10倍富硒组外均增加，趋势为蛹虫草浓度越高，体重增加的量越小，且高浓度富硒可能影响小鼠生长。小鼠的日食量及日饮量整体变化不明显。根据单因素方差分析，各脏器指数P＞0.05，无统计学意义，因此可知灌喂不同浓度蛹虫草不会对脏器造成损伤。

图3 高通量检测

灌喂21 d后，10倍普通组和10倍富硒组小鼠肠道中益生菌双歧杆菌和乳酸杆菌数量增加，其余组菌量减少，且致病菌肠球菌数量减少，其余组菌量增多。根据数据推测和大肠杆菌菌数也是灌喂高浓度蛹虫草时减少较多（10倍组），同时结合高通量对5倍组和0倍组肠道内容物的检测结果，证明灌胃蛹虫草后肠道菌群多样性增加。

通过以上数据分析，可证明蛹虫草可以改善小鼠肠道菌群：增加双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌的数量，减少肠球菌和大肠杆菌等致病菌数量；0倍组及10倍富硒组有最佳效果，可推测小鼠食用蛹虫草适宜浓度是3.033 mg/g，且总体上普通蛹虫草调节小鼠肠道菌群的效果要优于富硒蛹虫草。