双孢蘑菇多糖的提取及其抗氧化功效研究

石秀芹 许丹妮 张佳婵 王昌涛，2 安 全 李 萌*

（1北京工商大学理学院/植物资源研究与开发重点实验室，北京100083；2北京工商大学/北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京100048；3云南白药集团股份有限公司，云南昆明650501）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是一种近年来从食药用价值到经济效益均受到广泛研究的食用菌。食用菌的功效主要有：通过激活T细胞来提高机体的免疫力[1]；通过降低血糖、血压和胆固醇来维护心脑血管的健康[2]；抑制癌细胞的生长从而达到抗肿瘤的作用[3]。食用菌中的活性成分如多糖、超氧化物歧化酶等可有效清除自由基来延缓机体衰老、抗辐射等[4]。

真菌多糖是食用菌活性成分中最为重要的物质，真菌多糖具有：抗肿瘤，抗辐射，提高免疫力[5-9]，抗突变[10]，降血压、血脂、血糖[11-12]，抗氧化，延缓衰老[13-14]等多种功效。研究表明双孢蘑菇多糖在体外具有良好的抗氧化活性[15]。双孢蘑菇多糖的提取方法一般有水提法[16]、碱提法、酶辅助提取法[16]223、微波辅助提取法[17]、超声波辅助提取法[18]、双水相提取法等[19-21]。

多种真菌多糖在体外和体内均证明有良好的自由基清除率以及抗氧化活性[22-23]。目前，已经有多种天然活性提取物应用于化妆品中[24-25]。多项研究都可表明双孢蘑菇多糖在体内外具有良好的抗氧化功效，因此双孢蘑菇多糖可作为抗衰老化妆品的天然添加剂应用于化妆品中[26-27]。

邹伟等利用水浴振荡辅助酶法对双孢蘑菇多糖的提取工艺进行了优化[28]，刘丹赤等人探讨了微波辅助提取双孢蘑菇多糖的条件[17]61，高振鹏等研究了超声波辅助对双孢蘑菇多糖提取率的影响[20]，吴疆等则应用新技术双水相提取法提取了双孢蘑菇多糖[19]5。在优化双孢蘑菇多糖提取工艺的研究中，人们大多采用单因素法或正交法。然而，影响多糖提取率因素相当复杂，而且因素间通常又存在交互作用，因此通过单因素试验往往无法达到预期的效果。正交试验可同时考虑多个因素，以寻找最佳的因素水平组合。正交试验较单因素试验法更具优越性，试验次数明显少于同因素同水平的单因素试验。然而正交试验只能给出最佳因素水平组合，无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面法是通过设计合理的有限次数试验，建立数学模型，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件，克服传统正交法的缺陷。笔者研究响应面试验优化热水浸提双孢蘑菇粗多糖的最佳工艺，找出能够将双孢蘑菇多糖充分提取出来的最佳条件；并对双孢蘑菇多糖提取液进行浓缩、醇沉、冻干，得到粗多糖，采用凝胶高效液相色谱检测分子量，最后测定双孢蘑菇多糖在抗氧化、抗衰老等方面的功效。此研究为双孢蘑菇多糖能够作为一纯天然提取物应用到化妆品、保健品等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

双孢蘑菇（干）：福建古田产；苯酚：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（AR）：北京化工厂；葡萄糖标品：中国计量科学研究院；无水乙醇（AR）：国药集团化学试剂有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：国药集团化学试剂有限公司；水杨酸：安吉耐化学；FeSO4：国药集团化学试剂有限公司；H2O2：国药集团化学试剂有限公司；邻苯三酚：国药集团化学试剂有限公司；HCl：国药集团化学试剂有限公司；Tris：北京华威锐科化工有限公司。

1.2 仪器与设备

ZN-04B小型粉碎机：北京兴时利和科技发展有限公司；标准检验筛（40目）：浙江上虞市公路仪器厂；UVmini-1240分光光度计：日本岛津公司；低速大容量离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司；恒温水浴锅：北京中兴伟业有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣仪器有限公司；SHZ-CD型循环水真空泵：上海贝伦仪器设备有限公司；冷冻干燥机：Bencbtop K Virtis；凝胶色谱仪：沃特世科技（上海）有限公司（Waters）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品溶液的制备

将干双孢蘑菇粉碎过40目筛，按试验设计的料（g）液（mL）比、浸提温度（℃）、浸提时间（h），在水浴摇床内，以120 r/min进行热水浸提，然后冷却至室温，在4500 r/min条件下离心20 min收集上清液。

1.3.2 多糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定多糖含量，首先绘制标准曲线，然后测定多糖含量：取2 mL待测样品放入试管中，以2.0 mL去离子水做空白对照，加1.0 mL5%苯酚溶液混匀，再入加入5.0 mL浓硫酸混匀，5 min后封管沸水浴1 h；取出后冷却至室温，在490 nm处测吸光度，带入标准曲线计算多糖的质量浓度（mg/mL），并计算多糖提取率。

1.3.3 多糖提取单因素试验

称取10.000 g、40目的双孢蘑菇粉于250 mL锥形瓶中，加入去离子水，选择不同的料液比、提取时间和提取温度进行提取，离心得到上清液，取样测定吸光值，计算双孢蘑菇多糖提取率。

1.3.3.1 料液比单因素试验

准确称取5份双孢蘑菇粉，按照料（g）液（mL）比）为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入去离子水，60℃提取2 h。

1.3.3.2 温度单因素试验

准确称取5份双孢蘑菇粉，料液比为1∶40，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取2 h。

1.3.3.3 提取时间单因素试验

准确称取5份双孢蘑菇粉，料液比为1∶40，在60 ℃下分别提取1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。

1.3.4 响应面法优化试验设计

根据单因素试验的结果，遵循Box-Behnken中心组合设计原则，以料液比、提取时间和提取温度三个因子为自变量，以双孢蘑菇多糖的提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验。表1为响应面试验因素水平。

表1 响应面试验因素水平

1.3.5 双孢蘑菇多糖分离与分子量测定

1.3.5.1 双孢蘑菇多糖干品制备

用旋转蒸发仪将双孢蘑菇多糖旋蒸至适量（以减少无水乙醇的使用量），向浓缩液中加入3倍体积无水乙醇并低温沉淀，4℃过夜后可见棕色絮状粗多糖析出，再4500 r/min离心20 min，收集沉淀物后冷冻干燥，可得多糖粗品。

1.3.5.2 双孢蘑菇多糖分子量测定

测定条件：利用Waters 2414示差折光检测器与DAWN HELEOS十八角度激光光散射仪，KS-805与KS-803色谱柱串联；设定RID温度为50℃，流动相为 0.1 mol/L NaNO3（含 0.02%NaN3），进 样 量 为50 μL，流速为0.8 mL/min。

1.3.6 双孢蘑菇多糖抗衰老研究

1.3.6.1 对DPPH自由基清除试验

取3 mL待测液与3 mL DPPH溶液混匀，在517 nm下测吸光度（A1）；取3 mL去离子水与3 mL DPPH溶液混匀，测517 nm吸光度（A2）；取3 mL去离子水与3 mL待测液混匀，测517 nm吸光度（A3）；计算清除率。

1.3.6.2 对羟自由基（·OH）的清除作用试验

在25 mL试管中加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水杨酸，最后加入3 mL1 mmol/L H2O2启动反应，置于37℃水浴中加热15 min，测510 nm处吸光度（A0）。再加入 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 待测液和 0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0 mL的蒸馏水共1 mL，加入3 mL 2 mmol/L FeSO4、3 mL 6 mmol/L水杨酸，最后加入3 mL 1 mmol/L H2O2启动反应，置于37℃水浴中加热15 min，测510 nm处吸光度（Ax）。考虑到1.0 mL待测液和水对体系吸光度的降低，分别加入3 mL 2 mmol/L FeSO4和6 mmol/L水杨酸，然后加入3 mL 1 mmol/L H2O2启动反应，置于37℃恒温15 min后测其吸光度（A00），最后加入1 mL蒸馏水后测一次吸光度（Axx），则有A降低=A00-Axx。

1.3.6.3 对超氧阴离子自由基（O2·-）的清除作用试验

（1）邻苯三酚自氧化速率测定

取50 mM pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL、去离子水4.2 mL于25 mL的试管中，充分混匀，置于37℃恒温水浴中20 min，然后立即加入在37℃恒温水浴中预热过的3 mM邻苯三酚溶液0.5 mL，充分混匀后倒入比色皿中，每隔30 s在325 nm处测定吸光度，随后计算线性范围内每分钟内吸光度的增加，以10 mM HCl溶液作为对照，记录结果。

（2）加入样品液后邻苯三酚自氧化速率测定

按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL 的待测样品，分别加入去离子水4.1 mL、4.0 mL、3.9 mL、3.8 mL、3.7 mL，同样以10 mM HCl为空白管作为对照。测定325 nm处的吸光度，每个样品设定3个平行，取其平均值。

其中：ΔA1/Δt为邻苯三酚自氧化时反应速度，ΔA2/Δt为加入样品后邻苯三酚自氧化时反应速度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对多糖提取率的影响

料液比对多糖提取率的影响如图1所示。

图1 料液比对多糖提取率的影响

从图1可以看出，双孢蘑菇多糖提取率随料液比的增大而上升，但是在料液比为1∶40以后逐渐趋于平缓。当料液比较小时多糖并未完全溶解，导致提取率较低；料液比过大时多糖已全部溶解达到饱和，提取率就会趋于平稳。因此确定最佳提取料液比为1∶40。

2.1.2 温度对多糖提取率的影响

温度对多糖提取率的影响如图2所示。

图2 温度对多糖提取率的影响

由图2可以看出，多糖提取率在温度为50～90℃时呈现先上升后下降的趋势。其原因是随着温度的升高，多糖溶解率上升，有利于多糖的溶出，但温度过高时会降低一部分多糖的活性，因此提取率又会逐渐下降。高温伴随高能耗，会增加提取成本，因此综合考虑，选择70℃为最佳提取温度。

2.1.3 提取时间对多糖提取率的影响

提取时间对多糖提取率的影响如图3所示。

图3 提取时间对多糖提取率的影响

由图3看出，随着提取时间的增加，多糖提取率逐渐上升，超过3 h以后多糖提取率又逐渐下降并趋于平稳。表明多糖提取率与时间有着密切的关系，时间过短则多糖溶解不充分，但时间过长提取率反而下降，可能因为时间过长使得多糖受到破坏。因此确定最适提取时间为3 h。

2.2 响应面法优化双孢蘑菇多糖提取率

2.2.1 响应面法试验方案及结果

根据软件Expert Software设计出的响应面试验方案及结果如表2所示。

表2 多糖提取率响应面试验结果

各因素经二次多项回归拟合后，得到双孢蘑菇提取率对料液比、反应温度、反应时间的二次多项回归方程：

用方差分析对对式进行分析，结果见表3。模型当中的P值用来检验各因素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性，在统计学上的显著性由F值检验。R2称为多元相关的相关指数，表示多项式模型方程拟合的可靠性，R2Adj是对回归方程式中变量过多的一种调整，表中R2=0.9041，R2Adj=0.7807，两者相差不大并且接近于1，表示回归方程效果较好，试验操作可信。由表3可知，该模型P=0.0078，小于0.01，表明二次方程拟合显著极高；失拟项P大于0.05，表明失拟项对于绝对误差不显著；经方差分析得到A（料液比），B（温度），C（时间），A2对多糖提取率的影响显著，A、C交互作用显著，C2极显著，其余项不显著，说明各因素对双孢蘑菇多糖提取率的影响非常复杂。由P大小可判断各因素按影响大小排序依次为：料液比＞提取温度＞提取时间。

表3 线性回归模型的方差分析

2.2.2 对响应面模型的分析

响应面图可以比较直观地反映各因素之间的影响，通过多元回归方程所作的响应面如图4，图5和图6所示。根据模型可对任何两因素交互影响提取率的效应进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平范围。由图4、5、6可知，提取率的等高线呈椭圆形，说明料液比、温度、时间之间相互作用显著；在一定范围内，提取率均随着A、B、C的增加呈先上升后趋于平缓的趋势，说明提取率与A、B、C因素呈现正相关。

根据软件建立的数学模型，可以得出用热水浸提双孢蘑菇多糖的最佳工艺条件是料液比为1∶50，提取时间为2.6 h，提取温度为79.79℃，在这个条件下双孢蘑菇多糖提取率为2.36%。按优化条件进行3组平行试验，实际测得值为2.25%（P＜0.05），与理论值很接近，说明方法可行。

图4 料液比和提取时间交互影响多糖提取率响应面图

图5 提取温度和提取时间交互影响多糖提取率的响应面图

图6 料液比和提取温度交互影响多糖提取率的响应面图

2.3 双孢蘑菇多糖分子量测定结果

热水浸提的双孢蘑菇多糖提取液经醇沉、冻干后得到易溶于温水的棕色粉末。经凝胶色谱检测，热水浸提法提取的双孢蘑菇多糖相对分子量（Mw）为1.697×106Da。如图7所示。

图7 双孢蘑菇多糖相对分子量

2.4 双孢蘑菇多糖对DPPH自由基的清除率

将2 mg/mL的双孢蘑菇多糖分别稀释10倍、50倍、100倍、150倍，200倍、250倍，测得的自由基清除率如图8所示。

图8 双孢蘑菇多糖对DPPH自由基的清除率

由图8可以看出，双孢蘑菇多糖对DPPH自由基的清除作用明显。随着稀释倍数的增加，双孢蘑菇多糖对DPPH自由基的清除率下降，说明该多糖与DPPH的清除率存在好的量效关系。当多糖浓度为2 mg/mL时对DPPH自由基的清除率高达70%。

2.5 双孢蘑菇多糖对羟自由基的清除率

当多糖浓度为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2 mg/mL时对羟自由基清除率如图9所示。

图9 双孢蘑菇多糖对羟自由基的清除率

由图9可以看出，随着多糖浓度的升高对羟自由基的清除率有所上升，当多糖浓度为2 mg/mL时羟自由基清除率仍有上升趋势。由此也可以得出双孢蘑菇多糖对羟自由基有清除效果。

2.6 双孢蘑菇多糖对超氧阴离子自由基的清除率

双孢蘑菇多糖对超氧阴离子自由基的清除效果见图10。

图10 双孢蘑菇多糖对超氧阴离子自由基的清除率

由图10可以看出，双孢蘑菇多糖对超氧阴离子自由基的清除效果并不理想。随着多糖浓度的升高，对超氧阴离子的清除率只从0.25%上升到0.45%。是否是测量造成误差或者双孢蘑菇多糖对超氧阴离子自由基没有清除效果，还有待研究。

3 小结

经过单因素法和响应面法优化热水浸提双孢蘑菇多糖的最佳条件是料液比为1∶50，提取温度为79.79℃，提取时间为2.6 h，在这个条件下，多糖得率为2.25%。双孢蘑菇多糖水提液低温醇沉后得到易溶于温水的棕色粉末，该粉末为双孢蘑菇多糖干品，经测定得出相对分子量为1.697×106Da。双孢蘑菇多糖对三种自由基的清除效果中，以对DPPH自由基的清除效果最好。

对双孢蘑菇多糖的提取工艺优化及对多糖结构初步鉴定，为后续研究和工业化生产提供参考。由于多糖结构复杂，其结构鉴定一直是多糖研究中的难题。进一步纯化双孢蘑菇多糖，得到明确的双孢蘑菇多糖结构也是后续的研究方向之一，同时这也是建立双孢蘑菇多糖的构效关系的必要前提。双孢蘑菇多糖的体外清除自由基试验结果表明其具有良好的抗氧化活性，可进一步从生化试验、人体及细胞多角度综合判断来建立双孢蘑菇多糖抗衰老活性与结构和量之间的关系。