五株野生鸡腿菇生物学特性比较分析

郝雅荞 邢 岩 徐煜东 钱玙呈 沈 琦 迟天舒 王升厚* 赵洪新*

（1沈阳师范大学生命科学学院，辽宁沈阳110034；2西丰县房木镇政府，辽宁铁岭112000；3浙江理工大学生命科学与医药学院/浙江省植物与次生代谢重点实验室，浙江杭州310018）

鸡腿菇（Coprinus comatus），学名毛头鬼伞，隶属于担子菌亚门，伞菌纲，伞菌目，伞菌科，鬼伞属，因其形如鸡腿，肉质似鸡丝而得名，是一种珍稀的食用药用真菌[1]。鸡腿菇味道鲜美、营养丰富，特别是近年来研究表明其对糖尿病具有辅助治疗功效[2]，使其备受消费者的青睐，市场需求越来越大。然而在实际生产中，始终保持优良性状的鸡腿菇种源较少，菌种容易出现退化现象，而且鸡腿菇较脆、易自溶，导致耐贮性较差。商品菇如果采摘时候稍有偏差或市售拖延，都会造成品质急剧下降，从而滞销。因此，选育不易退化，韧性好、耐储藏的优质鸡腿菇新菌株是鸡腿菇生产中亟待解决的问题。

野生菌株是优良品种选育和驯化的重要来源之一。笔者以来源不同的5株野生鸡腿菇和2株生产菌株为出发菌株，从菌株间亲缘关系入手，采用拮抗反应和分子鉴定手段，对7株菌株进行亲缘关系比较；并通过出菇试验比较不同来源菌株的菌丝活力与子实体差异，以期获得优良的野生鸡腿菇新菌株，为选育优良鸡腿菇菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试鸡腿菇菌株与培养基

5株野生菌株（西丰县房木乡1株，沈北新区2株，浑南新区2株）和2株生产菌株（康平）的信息见表1。

表1 供试菌株来源

培养基：PDA培养基（马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然）；栽培料：玉米芯78%，麸皮20%，石灰1%，石膏1%，料含水量65%左右，发酵灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 供试菌株分离与培养

采用组织分离法获得野生鸡腿菇母种：对来自不同采集地点、生长良好的野生鸡腿菇子实体编号，在超净工作台内用75%酒精表面消毒，用无菌解剖刀从菌柄处切取小块组织，接种于PDA斜面培养基中，置于25℃下避光培养10～15 d。每隔2天检查污染情况，再次挑取目标菌株菌丝进行转接、纯化、入库保存。

菌株活化培养：将供试菌株转接至PDA平板中，置于25℃恒温箱中避光活化培养7 d左右，待菌丝布满平板时取出置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 供试菌株间拮抗试验

采用平板对峙方法：取供试菌株母种在平板中活化7～10 d，待其全部长满后分别用6 mm打孔器打取菌饼，定量接种在同一PDA平板中央等距离的两点，7个菌株之间分别进行两两拮抗试验。接种后平板置于25℃恒温培养7～10 d，观察供试菌株之间拮抗情况。

1.2.3 基因组DNA提取

供试鸡腿菇菌株接种于PDA液体培养基中，125 r/min、25℃摇床培养7 d，取约1 g菌丝加入液氮研磨，转入离心管中，利用真菌DNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取菌丝体DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，4℃保存备用。

1.2.4 ITS扩增及序列分析

提取的鸡腿菇DNA样品送上海生工生物工程股份有限公司测序，采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行扩增，测序结果提交到GeneBank数据库中，并进行blast比对，通过MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.2.5 菌丝生长和子实体差异比较分析

菌丝生长比较：用直径为6 mm的打孔器在发好菌的鸡腿菇平板菌种上打取菌饼，分别接种至PDA平板上，25℃恒温培养5 d，测定菌落直径，计算菌丝平均生长速度。

出菇试验：制备栽培料装袋，121℃灭菌1.5 h，冷却后接种，置于25℃恒温发菌，菌丝长满袋后进行覆土及出菇管理。记录供试菌株出菇情况，并比较子实体性状及品质差异。

可溶性多糖含量比较：采用蒽酮硫酸法测定鸡腿菇子实体中可溶性糖含量，并通过统计软件SPSS20.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 供试鸡腿菇菌株的采集与初步鉴定

经形态学初步判定采集到的5株菌均为鸡腿菇。经组织分离及纯化培养后获得野生鸡腿菇母种，保存于沈阳师范大学微生物实验室。

2.2 拮抗试验

图1为供试菌株两两拮抗的结果，共21组。由图1可见，供试菌株间出现了不同程度的拮抗反应。其中b组（野23-1与野23-2）无拮抗线，表明二者系同一菌株或亲缘关系非常近；除l组（野23-2与康平1）拮抗反应较弱外，其余各组均出现较强拮抗反应。

图1 鸡腿菇的拮抗反应

2.3 ITS序列分析

由图2可知，供试菌株均属毛头鬼伞，供试的7个菌株系统发育树如图2。野23-1与野23-2处于同一分支，其亲缘关系较近，与拮抗试验结果相符。

2.4 供试菌株菌丝活力与子实体差异分析

2.4.1 供试鸡腿菇菌株菌丝活力

如图3、图4可见，培养5 d的鸡腿菇菌丝生长状态存在明显的差异：菌丝形态（图3），野19、校园01、康平01和康平02基本上已经布满平板，但菌丝密度较小；野23-1、野23-2和野11中三个菌株菌丝浓密、洁白，但生长速度慢。由图4可见，经Duncan检验表明，在P＜0.05水平上菌丝生长速度：野19、校园01、康平01与康平02间无显著性差异，并且显著快于野23-1、野23-2和野11中，其中野23-1、野23-2与野11中菌株间菌丝体生长速度具有显著性差异。野23-1菌丝生长速度较快，其次是野11中，野23-2最慢。

2.4.2 供试菌株鸡腿菇出菇情况与子实体品质比较

图2 供试7个鸡腿菇菌株ITS聚类分析

图3 供试鸡腿菇菌株菌丝生长状态（培养5 d）

图4 鸡腿菇菌丝生长速度

所栽培7个鸡腿菇菌株中只有三个菌株出菇，为野23-1、野11中、康平01，其余均不出菇；并且康平01子实体质地松软，易自溶（4℃保存24 h即开始发生自溶现象），表明该菌株已经出现较严重的退化，且遗传稳定性不佳。相比而言野生菌株野23-1和野11中的子实体质地坚硬，并且4℃保存时间更长，可达7 d。

2.4.3 子实体多糖含量差异

出菇的3个鸡腿菇菌株（野23-1、野11中和康平01）子实体多糖含量上存在显著差异。由Ducan和LSD检验表明在P＜0.05水平，野23-1子实体多糖含量最高，为[2.35±0.10（a）]%，显著高于野 11中[1.68±0.04（b）%]及康平01[1.08±0.06（c）%]。多糖含量是评价鸡腿菇品质的重要指标之一。由此可以看出供试野生鸡腿菇营养成分优于栽培种，同时也表明生产菌种可能存在较严重的退化。若能保证野生鸡腿菇高品质，适当采取某些手段，如培养条件优化或遗传育种等方式对其进行驯化，进一步提高其产量，极有可能获得较理想的效果，即获得优质、高产的野生鸡腿菇新品种。

图5 出菇与保存状态

3 小结与讨论

采用了形态学和分子生物学两种方法相结合对来源不同的五株野生菌进行鉴定，通过形态和分子生物学鉴定，确定五株野生菌均为毛头鬼伞（Coprinus comatus），即鸡腿菇。经拮抗试验发现野生菌株野23-1与野23-2基本没有拮抗线，其余各组均出现不同程度的拮抗反应，表明野23-1与野23-2处于同一分支，亲缘关系非常近，同时与其他菌株距离较远，ITS系统发育分析结果类似。

菌丝生长长势中，校园01和康平02长势相近且同其他菌株相比长势最好，菌苔直径较大，表明菌丝体分裂旺盛；野19和康平01次之；野23-1、野23-2和野11中长势最差，但其菌丝更为洁白、厚实。

野23-1和野11中子实体洁白、质地厚实，尤其是野11中子实体在耐贮性方面表现优良，在4℃条件下保存时间可达7 d，因其采集时间为11月，可见该菌株具有较强的抗寒能力。野23-1虽然在七个菌株中长势最差，但其菌丝浓密洁白，可能具有较强的抗自溶性，同时因其与其他菌株间遗传距离相对较远，因此有可能作为遗传育种的亲本。此外，在出菇试验中部分菌株不出菇，其中包括生产菌种康平02，而康平01尽管可出菇，但子实体质地松软、在4℃保存24 h即开始发生自溶现象，表明两菌株已经出现较严重的退化，因此对菌株的提纯复壮工作不能间断。

野23-1和野11中子实体可溶性多糖含量均显著高于生产菌株康平01，由此可以看出野生鸡腿菇营养成分还是占有优势，如果能提高其产量，则可获得更大的效益。

通过形态观察、菌株间拮抗试验、ITS序列分析等对7株来源不同（包括5个野生鸡腿菇菌株及2个生产菌株）的鸡腿菇菌株进行鉴定及亲缘关系比对，结果表明，除野23-1与野23-2亲缘关系较近以外其他各菌株之间遗传距离较远，分别属于不同的菌株，生长状态差异显著；出菇试验与子实体差异对比表明野23-1和野11中，具有子实体洁白、质地坚硬、可溶性多糖含量高、耐贮藏的优点，但两菌株产量低、生长速度较慢，相比野23-1优势明显，可作为选育高产的野生鸡腿菇新品种亲本。