痹痛凝胶贴膏提取工艺和基质配方研究

李智勇，王洛临，张建军，陈玉兴，卢 泳,3

（1.广东省第二中医院广东省中医药工程技术研究院，广州 510095；2.广东省中医药研究开发重点实验室，广州 510095；3.广州中医药大学，广州 510405）

痹痛膏为广东省第二中医院的临床验方，主要由两面针、制川乌、桂枝、生姜等中药组成，具有祛风除湿，温阳散寒，通络止痛的功效，用于颈腰腿痛、四肢骨关节疼痛属风寒湿痹型者。根据临床的需求，现将其开发成现代经皮给药制剂凝胶贴膏，本研究对制备工艺进行筛选研究，为制剂生产奠定基础。

1 试验材料

1.1 试验设备与仪器 DC-NSG-30 型多功能提取浓缩机组（上海达程）；Agilent1200系列高效液相色谱仪（美国），Agilent extend XDB-C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），METTLER XS-205DU型电子分析天平（瑞士），DZF-6050 型真空干燥箱（上海一恒），BT-S-1 型小型试验巴布剂膏涂布机（温市皓丰），BBV-T 型初黏力测试仪（济南格瑞特），持黏力测试仪（济南格瑞特）。

1.2 试药 试验所用饮片均由广东省第二中医院制剂室提供；氯化两面针碱（110848-200603）购自中国药品生物制品检定所；麝香追风膏（批号：A14031，国药准字：Z44020391，广东湛江吉民药业股份有限公司）；冰醋酸（批号：20131216，天津市大茂化学试剂厂）。

1.3 动物 SPF 级NIH 小鼠，雌雄各半，实验设施合格证号为SCXK（粤）2013-0002，动物合格证号为44007200012462，由广东省医学实验动物中心提供。本实验使用SPF 级动物实验室，设施使用许可证号为SYXK（粤）2010-0059。

2 试验与结果

2.1 提取工艺路线筛选

2.1.1 提取工艺路线方案 根据文献分析，可以明确同痹痛凝胶贴膏功效主治相关的主要药理作用为抑菌抗炎、解痉、镇静镇痛、解热、抗过敏、抗变态反应、改善微循环等，其相关的主要有效成分生物碱[1-3]、黄酮[4-5]、挥发油[6]等主要存在于挥发油和水提取液中。因此拟定不同的提取工艺路线，采用其对冰醋酸所致小鼠疼痛扭体反应的影响作为评价指标进行工艺路线筛选。

2.1.2 供试品的制备 样品一：按处方比例，称取饮片304.5 g，生姜榨汁；其余药味煎煮2 次，每次加10 倍量水，煮沸1 h，合并煎液滤过，滤液浓缩至相对密度至1.15～1.20（60 ℃）的清膏，加入生姜汁和5%的卡波姆溶液，混匀，制成1 g 样品相当于0.765 g 饮片，备用。样品二：按处方比例，称取饮片304.5 g，生姜榨汁；桂枝等蒸馏法提取收集挥发油，药渣与其余饮片煎煮2 次，每次加10 倍水，煮沸1 h，提取液与提取挥发油的水溶液合并，滤过，滤液浓缩至相对密度至1.15～1.20（60 ℃）的清膏，加入挥发油、生姜汁、5%的卡波姆溶液，混匀，制成1 g 样品相当于0.798 g 饮片，即得。样品三：按处方比例，称取饮片304.5 g，生姜榨汁，其余药味粉碎成细粉，加入5%的卡波姆溶液中，混匀，制成1 g 样品相当于0.278 g 饮片，即得。

2.1.3 不同工艺样品对冰醋酸所致小鼠疼痛扭体反应的影响 实验前动物去毛：实验前1 日将小鼠背部先用婴儿电动理发推去毛，再用8%的硫化钠溶液脱毛，小鼠脱毛面积2 cm×2 cm，注意避免动物皮肤受损，脱毛后以温水轻轻清洗去毛区皮肤，24 h 后检查去毛区皮肤是否有损伤。分组：选取皮肤脱毛无损伤小鼠80只，雌雄各半，随机分为对照组、麝香追风膏组、样品一高低剂量组、样品二高低剂量组和样品三高低剂量组，每组10 只。麝香追风膏剂量为1.72 g 膏·kg-1，样品一、二、三高剂量为5.28 g 饮片·kg-1、低剂量为1.32 g 饮片·kg-1。给药：供试品样品各剂量组及阳性对照药药膏使用前置于40 ℃水浴锅中温浴加热，保持40 ℃膏温，各组去毛区皮肤小鼠按剂量涂敷给药，1 次/d，连续5 d，对照组同法涂敷等重量膏体基质。

末次涂敷药物结束0.5 h 后，各组小鼠均腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1 mL·10 g-1体重[7]，计时，记录20 min内各组小鼠出现的扭体反应次数，计算抑制率。见表1。

表1 各样品组对冰醋酸所致小鼠扭体反应的影响（，n=10）

表1 各样品组对冰醋酸所致小鼠扭体反应的影响（，n=10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与麝香追风膏组比较，△P＜0.05

结果显示，与对照组比较，麝香追风膏组和样品各剂量组对小鼠扭体潜伏期均明显延长（P＜0.01），扭体次数均显著减少（P＜0.01）；与麝香追风膏组比较，样品各剂量组对小鼠扭体潜伏期、扭体次数均无统计学意义（P ＞0.05）；各样品组间等剂量组之间比较，小鼠扭体潜伏期、扭体次数均无统计学意义（P ＞0.05）；考虑到生产的便易性，选择工艺一为本品的提取工艺，即生姜榨汁，其余饮片加水煎煮提取。

2.2 提取工艺研究 以氯化两面针碱含量和干膏得率为评价指标，采用正交试验法，对影响提取效果的提取次数、加水量和提取时间进行优选，因素水平分别为：A 提取次数为1，2，3 次；B 提取时间为1.0，1.5，2.0 h；C 加水倍量为10，12，14 倍。

2.2.1 评价指标选择

2.2.1.1 干膏得率的测定 精密吸取各样品溶液20 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，照干燥失重测定法（《中国药典》2015 年版4 部通则0831 干燥失重测定法）测定，计算干膏得率。

2.2.1.2 氯化两面针碱的含量测定 色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.02 moL磷酸二氢钾溶液（磷酸溶液PH5.2）（30:70）为流动相；检测波长为328 nm，流速为1 mL/min。对照品溶液的配制：精密称取氯化两面针碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含45.88 μg 的溶液，即得。供试品溶液的制备：量取提取液适量（相当于含两面针0.3 g），置25 mL 量瓶中，加甲醇15 mL，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。阴性对照溶液的制备：称取处方中除去两面针的其余饮片，依法提取制备两面针阴性对照样品，并按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。测定法：分别精密吸取上述各10 μL，注入高效液相色谱仪测定，即得。

2.2.2 样品的制备 按处方比例，称取饮片9 份，每份274.5 g，照正交设计表进行提取，滤液浓缩并定容至250 mL，分别测定干膏得率和氯化两面针碱的含量。见表2～表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由直观分析结果可见，影响提取效果的因素顺序为：（A）＞（B）＞（C），最佳工艺组合为：A3B3C2。方差分析结果表明，提取次数对提取效果具有统计学意义（P＜0.10），提取时间和加水倍量对结果均无显著影响，综合考虑生产效率和节能等因素，确定的优选工艺组合，即加水煎煮3 次，每次加10 倍量水，煎煮1 h。

2.2.3 验证试验与结果 按处方比例称取饮片3 份，每份366 g，分别照拟定的工艺煎煮，浓缩，转移至500 mL 容量瓶中，并加水至刻度，摇匀，依次测定，计算。

结果：3 次验证试验的氯化两面针碱平均含量为45.692 6 μg/g，平均干膏得率为17.95%，平均综合评分为99.98，与正交试验最大综合评分值接近，说明拟定工艺条件合理，可行。

2.3 浓缩工艺考察 取各味饮片1 098 g，照拟定工艺提取，合并提取液，混匀，平均分为2 份，分别进行浓缩工艺考察，其中常压浓缩和减压浓缩（60～70℃，-0.06 MPa）各1 份，并分别测定氯化两面针碱的含量。

结果显示，2 种浓缩液中氯化两面针碱含量分别为29.920 5 μg/g 和29.163 6 μg/g，2 者之间无明显差异，因此可以选择常压浓缩工艺，进行浓缩至相对密度1.25～1.35（60 ℃）。

2.4 成型工艺研究

2.4.1 痹痛凝胶贴剂的制备 将卡波姆均匀散入姜汁水溶液，静置溶胀12 h；在分别加入适量三乙醇胺、蓖麻油、甘油、甘羟铝、高岭土，浸膏，搅拌均匀，涂布，分割，晾干，即得。

2.4.2 凝胶贴剂质量评价指标及检测方法

2.4.2.1 初黏力 按照《中国药典》2015 年版4 部通则0952 黏附力测定法第一法测定[7]，每个样品平行测定5 次，以测得最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算初黏力得分。

2.4.2.2 持黏力试验 按照《中国药典》2015 年版4部通则0952 黏附力测定法第二法测定[7]，以50 g 的砝码试验，记录试验开始至滑脱的时间，每个样品平行测定5 次，以测得最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算持黏力得分。

2.4.2.3 外观评价评分标准 按照文献方法[8]分别对基质均匀性、表面光泽度、气泡状态等进行评价，并对各项的综合得分按权重求和，以最大值为100 分，并按照（测得值/最大值）×100 计算外观评价得分。

2.4.3 考察因素及水平 本试验根据前期结果，凝胶贴膏基质选用卡波姆为黏合剂，高岭土为填充剂，甘油为保湿剂，甘羟铝为交联剂。采用均匀实验设计法[9]进行凝胶贴膏基质处方的筛选，各因素及水平，见表4。

表4 试验因素与水平

2.4.4 实验及结果 选用U13（137）均匀设计表，分别制备痹痛凝胶贴膏，并测定初黏力和持黏力及外观评分，见表5。

表5 均匀设计试验方案与结果

2.4.5 数据处理与分析 以综合评分为指标，各因素为变量，利用软件进行逐步回归分析，得回归方程：Y=51.284 3-2.6121X7-0.002 1X62-0.238 4X72-0.012 2X1×X6+2.882 8X2×X4+0.681 2X3×X4+0.041 5X3×X6-0.338 7X3×X7+0.017 9X4×X5-0.342 5X4×X7+0.067 4X6×X7，数据经调整后的相关系数为r=0.999 7，F=1 735.308 0，S=0.318 8。此方程经F 检验具有统计学意义，方程成立。由该方程可知，制备痹痛凝胶贴膏的制剂最佳配方比例，浸膏干粉:甘羟铝:卡波姆:高岭土:甘油:蒸馏水:蓖麻油=7.0:1.5:9.0:3.2:54:180:11.5。

2.4.6 验证试验 按照最后优选得出的凝胶贴膏基质处方制备3 批痹痛凝胶贴膏样品，结果3 批样品的平均综合评分达96.57，表明该处方配比进行优选合理可行。见表6。

表6 验证试验结果

表明该处方配比进行优选合理可行，而且按优选所得结果制备的痹痛凝胶贴膏的黏度符合要求，外观平整光滑，符合外观评价各项指标的标准，膏体的保湿度、延展性等各方面均符合标准。

3 讨论

由于原处方临床应用为全方粉碎入药，而当前的凝胶贴膏的载药量有一定的限度，因此在将痹痛膏制备成凝胶贴膏的过程中遇到给药量较小的问题。由于中药具有成分多样，作用机制多靶点的特点，中药提取可能导致与原处方的药效的变化。本研究在对处方药味进行文献调研的基础上，根据处方中各药味与本制剂功能主治有关的有效成分化学性质以及药理活性作用，拟定不同的提取工艺，基于药效学研究开展痹痛凝胶贴膏提取工艺路线筛选，从而保证提取物与原处方药效一致性，为其进一步研究奠定基础。

均匀试验设计是近年来迅猛发展的一种崭新的试验设计方法[11]，建筑设计、工业生产，它可使试验点在试验范围内均匀散布能有效地选择有代表性的试验点，以尽可能降低试验次数，从而降低成本，提高优化筛选的效率，尤其适合医药工艺中多因素、多水平的配方筛选与优化[12]。本研究中采用均匀设计试验优选了痹痛凝胶贴膏的制剂处方配方，验证结果显示，该制剂工艺所得结果制备的痹痛凝胶贴膏的黏附性良好，外观平整光滑，外观评价各项指标的良好，可以用于痹痛凝胶贴膏的生产。