加减膈下逐瘀汤对气滞血瘀型慢性输卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB 表达影响

郑 跃，刘 丽，刘建秋

（黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

慢性输卵管炎作为妇科的一类常见疾病，常可导致输卵管肥大、积脓及积水等症状，并为导致女性不孕的关键因素。由于现代药物流产以及人工流产事件的增加，由输卵管原因所导致的不孕症亦呈上升趋势。本研究通过建立大鼠气滞血瘀型慢性输卵管炎模型，探究膈下逐瘀汤对模型大鼠输卵管中炎性因子ICAM-1、NF-κB 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8～12 周的SPF 级雌性SD 大鼠，体质量（200±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK（黑）2015-004。饲养温度22 ℃，相对湿度40%左右。

1.2 实验药品与试剂 水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批号160209）、乌拉坦（上海山浦化工有限公司，批号151220），ICAM-1、NF-κB 一抗购自北京博奥森生物技术有限公司。水合氯醛、乌拉坦（上海山浦化工有限公司）、金黄色葡萄球菌（菌号ATCC29213，北京东方赛瑞生物技术有限公司），总RNA 提取试剂Trizol，BCA 蛋白试剂盒，试剂盒及ICAM-1、NF-κB 蛋白试剂盒（大连宝生物有限公司）。膈下逐瘀汤（GD）方药组成：赤芍20 g，牡丹皮15 g，桃仁15 g，川芎15 g，枳壳15 g，延胡索20 g，香附20 g，乌药15 g，地龙15 g，鳖甲15 g。（由黑龙江中医药大学中草药房提供）。康妇炎胶囊（山东步长神州制药有限公司，150530，服用方法：3 粒/次，2 次/d）。

1.3 分组与构建模型 雌性SD 大鼠，52 只，随机分为4 组，分别为空白组（K）、模型组（M）、对照组（D）、膈下逐瘀汤组（G），每组 13 只。K 组不予任何处置，其余3 组在实验第1 天以10%水合氯醛（0.04 mL/kg）腹腔注射麻醉实验大鼠，后将实验大鼠侧卧式平放，常规剃毛、消毒，取肋缘过肾区0.5 cm 近脊柱侧旁开1 cm 长的横切口，打开腹腔，暴露一侧卵巢、输卵管及部分子宫，向输卵管方向注入配置好的4×109/mL 金黄色葡萄球菌悬液0.1 mL，后逐层缝合腹壁，并消毒切口，另一侧输卵管操作方法同前。在第8 天时，给予D、G 2 组模型大鼠不可预知的慢性长期刺激，包括大鼠足底每8～15 min 1 次并持续10～12 h 的电击刺激、噪声刺激、闪烁光刺激，夹尾4 min/次，8 次/d，45°倾斜鼠笼1 次/d，2 h/次，连续21 d，构建气滞血瘀模型[1-2]。

1.4 实验给药 在实验第29 天时，G 组于每日上午9时，对实验大鼠给予膈下逐瘀加减方（5.940 g/kg）灌胃1 次，同时D 组给予康妇炎胶囊（0.0648 g/kg）灌胃1 次，M 组用等体积纯净水代替，连续28 d。

1.5 样品的采集及检测 实验大鼠在第28 天给药后禁食不禁水12 h，常规消毒、备皮，以20%乌拉坦（10 mL/kg）腹腔麻醉，在无菌条件下解剖大鼠，取双侧输卵管，放入预先处理好的冻存管中，液氮速冻，右侧用于Real-time PCR 检测ICAM-1、NF-κB mRNA 表达，左侧用于Western Blot 检测ICAM-1、NF-κB 蛋白表达。

1.6 统计学方法 Real-time PCR 结果采用MX-3000P软件来分析各检测样本的Ct 值，Western-blot 结果使用NIH 的image J 软件扫描分析，数据转换到excel 上，以目的蛋白条带的灰度值与内参照β-actin 条带灰度值的比值来表示目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 引物信息 见表1。

表1 引物信息

2.2 气滞血瘀型慢性输卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB mRNA 表达 与空白组相比，模型组ICAM-1、NF-κB mRNA 表达升高显著（P＜0.01），提示大鼠慢性输卵管炎（气滞血瘀型）模型构建成功；与模型组比较，膈下逐瘀汤组ICAM-1、NF-κB mRNA 表达极显著下降（P＜0.01），可见膈下逐瘀汤对ICAM-1、NF-κB mRNA 表达有调控作用。见图1～图4。

图1 ICAM-1 溶解曲线

图2 ICAM-1 mRNA 表达

图3 NF-κB 溶解曲线

图4 NF-κB mRNA 表达

2.3 气滞血瘀型慢性输卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB蛋白表达 与空白组比较，模型组ICAM-1、NF-κB 蛋白表达升高（P＜0.01），提示ICAM-1、NF-κB 细胞因子发生了改变；与模型组比较，膈下逐瘀汤组可显著降低ICAM-1、NF-κB 蛋白表达水平（P＜0.01），提示膈下逐瘀汤对气滞血瘀型慢性输卵管炎有治疗作用。见图5。

图5 气滞血瘀型慢性输卵管炎模型大鼠ICAM-1、NF-κB蛋白表达

3 讨论

膈下逐瘀汤方中牡丹皮具有活血化瘀，清热凉血之功效；乌药、元胡可行气止痛；地龙、鳖甲助牡丹皮活血化瘀之功；且方中川芎在活血养血的同时，亦可行血中之气，进而增强逐瘀之力。研究[3]表明，ICAM-1 在血管内皮细胞中的表达呈低水平，甚或不表达，但是在炎症激联反应被触发之后，ICAM-1 则会与受体结合，进而激发内皮细胞分泌溶酶蛋白，促进炎性细胞因子的黏附作用，并通过淋巴细胞使得其表达上升。NF-κB 是一种具有多效性的转录因子，其可与多种基因启动子部位的κB 位点发生特异性结合，进而使其发生转录表达[4]。

本实验结果显示，与空白组比较，各组模型大鼠ICAM-1、NF-кB mRNA 及蛋白的表达均明显升高（P＜0.05），且以模型组升高最为显著（P＜0.01）；与模型组比较，膈下逐瘀汤组可极显著降低ICAM-1、NF-кB mRNA 及蛋白表达水平（P＜0.01）；说明膈下逐瘀汤对输卵管炎（气滞血瘀型）模型大鼠具有较好的干预作用，治疗效果显著，值得临床进一步探究及推广。