补肾活血方防治阿尔茨海默病的机制研究

刘盼兴，王 旭

（辽宁中医药大学中西医结合基础医学院，沈阳 110032）

阿尔茨海默病（alzheimer disease,AD）又名老年性痴呆，是危害人类健康的一种严重的神经退行性疾病，临床上主要表现为认知、记忆、智力、日常生活能力等方面的退化及改变[1]。该病病因复杂，医家对其病因病机进行研究探索中认为肾虚髓亏、瘀血阻络为该病的主要病因病机。从而，通过补肾活血法治疗AD 成为中医界的探究热点[2]。2009 年－2011 年期间，我院王恩龙教授[3]观察补肾活血中药对40 例老年性痴呆患者的临床疗效，发现补肾活血中药可以改善老年性痴呆患者的认知能力，提高患者的生活质量，但其中的作用机制却不甚了解。Iba1蛋白是小胶质细胞中的钙结合蛋白，该抗体已被广泛用作小胶质细胞的标记物；GFAP 蛋白是星形胶质细胞胶质丝的主要成分，该抗体是星形胶质细胞的标志性蛋白[4]，它们二者是促炎因子和氧化应激的重要来源，可分泌大量的促炎因子[5-6]，而炎性因子的增加，导致海马介导的认知功能破坏[7]，在中枢神经系统的炎症反应中发挥着至关重要的作用。所以我们采用水迷宫实验、免疫组化实验及Western blot 实验来探究补肾活血方治疗AD 的机制是否与其可以抑制炎症反应相关。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 将24 只7 月龄的SPF 级的SAMP8雄性鼠随机分为3 组，分别为模型组、盐酸多奈哌齐西药组和补肾活血方中药组，另外将8 只7 月龄的SPF 级的SAMR1 鼠作为正常对照组。造模时正常组和模型组小鼠按体质量给予生理盐水灌胃，西药组给予盐酸多奈哌齐灌胃，灌胃剂量为3 mg/（kg·d），中药组给予补肾活血方进行灌胃6 g/（kg·d），灌胃时间为4 周。

1.2 实验器材及实验动物灌胃药物的制备 检测试剂与仪器：兔多克隆GFAP 抗体（Abcam，美国），兔多克隆Iba1 抗体（Abcam，美国），β-actin 抗体（sigma，美国），组织蛋白裂解液、BCA 工作液等（碧云天生物技术有限公司）。Mirror 水迷宫自动实验记录仪，BIO-RAD 凝胶图像分析系统，电泳仪，电泳槽，湿转转膜槽，脱色摇床，Leica 石蜡切片机，超速冷冻离心机，Olympus 光学显微镜，电子天平，微波炉，恒温水浴箱。补肾活血方药物组成：丹参 20 g，川芎20 g，山药 15 g，熟地黄10 g，鹿角胶 10 g，枸杞子15 g，牛膝 15 g，菟丝子10 g，山茱萸 10 g。用药物总体积的4 倍量水浸泡2 h，沸后改文火煎，煎煮1 h 后倒出药液；继用药物体积2 倍量水，再煎2 次，合并3 次药液。滤过，滤液用文火浓缩至流浸膏，水浴继续浓缩至稠浸膏，真空干燥（80 ℃）得干浸膏。将干浸膏无菌条件装瓶，置4℃冰箱保存备用。盐酸多奈哌齐的制备：将盐酸多奈哌齐片（成人剂量为5 mg/d）置于纯净水中，经超声细胞粉碎机制成浓度为4 mg/mL 的混悬液，药物配制后置于4 ℃冰箱保存备用，用前摇匀。

1.3 Morris 水迷宫实验 灌胃28 d 后进行水迷宫适应训练，首先练习站台，可将小鼠放于平台上1 min，然后开始入水训练，每只小鼠训练2 次，从不同象限入水，1 min/次，如果找不到站台，应予以引导至站台，停留1 min。定位航行试验为期5 d，平台置于第三象限中心，小鼠分别于上午和下午各进行1 次试验，每次试验时间1 min，第一象限池壁的中点作为入水点，但放置平台的第三象限不作为入水点，上午和下午的入水顺序相同。如果大鼠在1 min 内未找到平台，由实验者将其引至平台，让其在平台上停留1 min，再放回笼内。以小鼠入水后到找到平台的游泳时间即逃避潜伏期做为观测指标，60 s 内未找到平台的记为60 s。空间探索试验于定位航行结束后次日上午撤除平台，在原平台象限的对侧象限即第一象限入水，记录的游泳轨迹，测量内小鼠在原平台象限停留时间并进行比较。数据搜集和处理由软件完成。

1.4 动物取材 待小鼠Morris 水迷宫实验结束后，将4 组小鼠置于乙醚罐中进行麻醉，待鼠深度麻醉后行断头处死，在冰盒内剥离小鼠的大脑，从中间矢状缝切开，将小鼠的大脑左半球置于4%多聚甲醛溶液中，进行固定，脱水、透明、浸蜡后常规制备石蜡切片，供免疫组织化学染色使用；小鼠大脑右半球仔细分离出海马和皮层，置于-80℃进行深度冰冻，供western blot 实验备用。

1.5 免疫组化实验 将鼠的大脑左半球制成石蜡切片后，进行免疫组化实验。将石蜡切片于烤箱内烤片1 h 后，进行脱蜡操作，然后PBS 液冲洗，之后柠檬酸缓冲液中微波修复，再次PBS 液冲洗后行山羊血清封闭0.5 h，滴加一抗，4℃过夜，PBS 液冲洗后再滴加二抗，PBS 冲洗后滴加三抗，PBS 冲洗，然后进行DAB 显色、核复染、脱水等操作，最后用中性树胶封片观察。

1.6 Western blot 实验 将鼠右脑的海马组织进行匀浆后行Western blot 实验。首先配胶，按照各比例备好胶板后，将其置于电泳槽中进行加样、预电泳和电泳操作，电泳完成后进行转印2 h，结束后弃胶，将膜取下置于丽春红染液后进行裁膜，然后用TBST 液洗膜，洗膜后开始滴加一抗，牛奶封闭，4℃过夜，再次用TBST 液洗膜，然后滴加二抗，再次用TBST液洗膜，最后进行曝光观察，图像采集及数据分析均由软件完成。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件建立数据库，并以均数±标准差（）表示各定量指标的平均值和分散程度。多样本均数的比较采用方差分析，两两比较采用LSD 及Dunnett’sT 3 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定位航行实验各组小鼠潜伏期用时比较 见表1。

表1 定位航行实验各组小鼠潜伏期用时比较（）s

表1 定位航行实验各组小鼠潜伏期用时比较（）s

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

2.2 补肾活血方对各组小鼠大脑海马区Iba1 表达的影响 免疫组化的结果显示，正常组SAMR1 鼠大脑海马CA1 区神经细胞形态完整，排列有序，无明显Iba1 阳性染色；与正常组SAMR1 小鼠比较，模型组SAMP8 鼠阳性细胞染色加深，Iba1 阳性细胞数量增多，对阳性细胞所占比例进行统计学分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组SAMP8 小鼠比较，中药组与西药组SAMP8 鼠的阳性细胞染色浅，Iba1 阳性细胞数量有不同程度减少，对阳性细胞所占比例统计分析，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1、图2）。采用western blot 法检测各组小鼠大脑海马内Iba1 蛋白（图3）。统计结果分析显示，与正常组SAMR1 小鼠比较，模型组SAMP8 小鼠Iba1 蛋白含量明显较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；经中药与西药处理后，与模型组小鼠比较，Iba1 蛋白含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组与西药组小鼠比较差异无统计学意义（P ＞0.05）（图4）。

图1 免疫组化法检测各组小鼠大脑海马CA1 区Iba1 的分布（scale bar=20 μm）

图2 各组小鼠大脑海马CA1 区Iba1 染色阳性细胞数量所占比例的差异比较

2.3 补肾活血方对各组小鼠大脑海马区GFAP 表达的影响 采用免疫组化法观察各组小鼠大脑海马区GFAP 的分布与表达，结果显示：正常组SAMR1 鼠大脑海马CA1 区无明显GFAP 阳性染色细胞；与正常组SAMR1 小鼠比较，模型组SAMP8 鼠阳性细胞胞体增大，突起增粗增长，染色加深，呈棕黄色，GFAP 阳性染色细胞数量增多，其阳性细胞所占比例差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组SAMP8小鼠比较，中药组与西药组SAMP8 鼠的阳性染色细胞多呈不规则、扁平的多角形状，胞体及突起角纤细，染色浅，数量有不同程度减少，阳性细胞所占比例差异有统计学意义（P＜0.05）（图5、图6）。采用western blot 实验方法来检测各组小鼠大脑海马内GFAP蛋白（图7），统计结果分析显示，与正常鼠比较，模型组小鼠GFAP 蛋白含量明显较高，且差异有统计学意义（P＜0.05）；经中药与西药处理后，与模型组小鼠比较，中药组与西药组小鼠大脑海马内GFAP蛋白含量减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组与西药组小鼠比较差异无统计学意义（P ＞0.05）（图8）。

图3 western blot 检测各组小鼠海马内Iba1 蛋白水平的表达比较

图4 各组小鼠大脑海马内Iba1 蛋白的相对值比较

图5 免疫组化法检测各组小鼠大脑海马CA1 区GFAP 的分布（scale bar=20 μm）

图6 各组小鼠海马CA1 区GFAP 染色阳性细胞数量所占比例的差异比较

图7 western blot 检测各组小鼠海马GFAP 蛋白水平的表达比较

图8 各组小鼠大脑海马内GFAP 蛋白的相对值比较

3 讨论

阿尔茨海默病（alzheimer’s disease,AD）是一种与增龄相关的中枢神经系统退行性疾病[8]。在中医学中一直认为“肾藏精生髓通脑”，肾与脑功能的关系密切。AD 的临床表现多与脑功能的缺失有关，但从脏腑理论中追其溯源，其发病之根本在于肾。各医家对AD病因病机的研究探讨大多从虚、实两端入手[9]。许多医家[10-12]认为肾虚髓亏、瘀血阻络为AD 形成的基本病机[13]。

在本次研究中发现，水迷宫实验中，与模型组SAMP8 鼠相比，正常对照组鼠在第3 天的逃避潜伏期明显缩短，说明正常组鼠经过2 天的实验适应，对水迷宫的内部环境更为熟悉，符合实验对正常组的要求。与模型组SAMP8 鼠相比，中药组和西药组SAMP8 鼠在第三天的逃避潜伏期亦缩短，而模型组鼠的逃避潜伏期却无明显变化，说明经过实验训练学习，中药组与西药组鼠能比模型组鼠更早的适应水迷宫的内部环境，较模型组鼠有更强的学习能力。另外，与模型组SAMP8 鼠相比，中药组、西药组的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），说明中药组与西药组SAMP8 鼠在西药与补肾活血方的治疗后，凭借水迷宫实验获取的记忆能力，能在更短的时间内找到并登上平台。免疫组化实验中，由GFAP 抗体与Iba1 抗体标记的星形胶质细胞与小胶质细胞在正常组SAMR1 鼠的海马CA1 区少有表达；与正常组SAMR1 小鼠相比，模型组小鼠海马CA1 区的两种染色阳性细胞有更为明显的表达，且差异有统计学意义（P＜0.05），该两种阳性细胞胞体增大，突起增粗增长，染色加深，呈棕黄色；而与模型组小鼠相比，中药组与西药组小鼠海马CA1 区星形胶质细胞与小胶质细胞数量明显较少，差异有统计学意义（P＜0.05），且该两种阳性细胞多呈不规则、扁平的多角形形状，胞体及突起角纤细，染色浅；在Western blot 实验中发现，与模型组小鼠相比，中药组与西药组小鼠的Iba1 与GFAP 蛋白含量均明显较少，且差异有统计学意义（P＜0.05）；而中药组与西药组小鼠两种蛋白含量相比，差异没有统计学意义（P ＞0.05）。通过免疫组化实验与Western blot实验可以得知补肾活血方可以抑制小胶质细胞与星形胶质细胞的过度表达，从而阻碍了该两种胶质细胞介导的慢性炎症反应，保护了机体的中枢神经系统，临床上对AD 有一定的治疗作用。

经理论研究及实验探索结果表明，补肾活血方可以通过间接抑制中枢神经系统的慢性炎症反应发生以改善SAMP8 小鼠的学习认知及记忆能力，保护机体神经系统的正常功能运行，从而对AD 起到治疗作用。但仅依靠免疫组化实验与Western blot实验得到的结果，无法探究补肾活血方除可以通过抑制神经系统内慢性炎症反应的发生这一机制治疗AD 之外，是否还有其他的作用机制，为解决这一问题，仍需我们进行更多更深一步的实验研究与探索。