鸡细小病毒与H9 亚型禽流感病毒三重PCR 检测方法的建立*

2020-02-08李丹谢芝勋李孟谢丽基罗思思张艳芳张民秀黄娇玲范晴王盛谢志勤邓显文曾婷婷

家禽科学 2020年1期

李丹，谢芝勋，李孟，谢丽基，罗思思，张艳芳，张民秀，黄娇玲，范晴，王盛，谢志勤，邓显文，曾婷婷

（广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

鸡细小病毒（chincken parvovirus，ChPV）为一种无囊膜单链DNA 病毒，由三个（NS、NP 和VP）开放阅读框组成。ChPV 是一种能引发鸡群发生肠道疾病的重要病毒之一，在临床上主要引起鸡精神抑郁、腹泻、生长迟缓和料肉比增加等[1]。 1983年，细小病毒首次在发生肠炎的发育不良的火鸡中发现[2]。 1984 年，匈牙利科学家Kisary 等人用电镜在鸡的粪便样品中观察到细小病毒颗粒，随后这些发现被基因组序列测定进行确定[3-4]。关于ChPV 的流行病学调查显示其在商品肉鸡的感染率较高，蛋鸡或种鸡次之[5]。该病毒普遍地存在于某些鸡群中，主要以雏鸡为侵害对象，会造成患病鸡的腹泻及发育不良，有研究表明在发育障碍与矮小综合征鸡群的血清中检测到了ChPV DNA[6]。近年来该病毒相继在北美、东欧及亚洲的多个国家地区[7-9]有发现报道，证明ChPV 在全球多个国家的鸡群中普遍存在。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属于甲型流感病毒，由于其最易发生变异以及近年来禽流感病毒的跨种传播而受到人们的关注[10]。依据不同AIV 毒株对鸡致病性的强弱，可以将AIV分为高致病性AI（HPAIV）、低致病性AIV（LPAIV）和非致病性AI（NPAIV)。H9亚型AIV 属于LPAIV，家禽感染发病后临床症状多表现为轻微的呼吸道症状，同时还会造成蛋鸡的产蛋率下降、肉鸡的生长发育迟缓等；野禽、水禽和家禽携带该病毒时大部分不表现出任何明显的临床症状，但会对机体造成一定的损伤，是目前影响我国养禽业发展的重要禽类病毒病之一[11]。 H9N2亚型AIV 最早于1966 年在美国威斯康辛州的火鸡中被分离到[12]。我国广东地区于1994 年首次在AIV 引起发病的鸡体内发现H9N2亚型AIV[13]。研究表明H9亚型AIV 容易与其他病原（病毒和细菌等）混合感染加重疾病造成的损失；其还可以与其它不同亚型的AIV 混合感染，并在宿主体内发生基因片段重组，产生一些不可预知的新型流感病毒，进而可能引起大流行。 H9亚型AIV 可以跨种属屏障感染人类，上世纪90 年代末以来多次发生H9N2亚型AIV感染人的事件，特别是对2013 年以来引起人感染的H5N6、H7N9和H10N8亚型AIV 的基因来源分析中发现其内部基因均来自H9N2亚型AIV[14-16]。由上述报道可见，H9N2亚型AIV 与ChPV 都对家禽养殖业造成了严重的危害。

由于ChPV 很难在正常鸡胚和细胞中增殖培养，目前仅依靠PCR 技术直接检测肠道内容物或泄殖腔棉拭子样品中是否存在目标病原的核酸，进而判断样品有无该病原体的感染。目前，禽流感病毒的诊断方法较多，其中最常用的是分子生物学方法，特别是PCR 检测方法，其具有简便、敏感性高及特异性好的优点而得到广泛应用。近年来，由于多重PCR 诊断技术随着科技的发展而不断完善，同时只有对多种病原体混合感染的优点，而且可以大大缩短对混合样品进行逐项检测的时间，已经被成熟应用于多种动物病原混合感染的诊断。为此，本研究根据H9亚型AIV HA 基因、所有AIV 的M 基及ChPV 的NS 基因的保守序列，设计3 对针对两种病毒的特异性引物，建立了ChPV与H9亚型AIV 三重PCR 检测方法，不仅可以快速准确地鉴别上述两种不同病原的混合感染，而且为ChPV 与H9亚型AIV 的有效防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器试剂包括：购自北京全式金生物技术有限公司的试剂有2×PCR Super Mix，DNA/RNA 共提试剂盒、小量质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、感受态细胞、PCR 产物快速连接载体和DNA Marker；购自宝生物（北京）有限公司的试剂有M-MLV、随机引物、dNTP 及RNA抑制剂；其它试剂均购自商业公司。仪器包括：购自美国Bio-Rad Laboratories 公司的PCR 仪，购自美国Thermo 公司的超微量分光光度计。

1.1.2 毒株毒株（H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV）均由广西兽医生物技术重点实验室保存；H7N2亚型AIV 的cDNA 模板由美国宾夕法尼亚州立大学惠赠；H5N1亚型AIV 的cDNA 模板由美国康涅狄格州立大学惠赠；其它AIV（H2N3、H8N4、H10N3和H11N3）毒株或cDNA 模板均由香港大学惠赠。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计和合成运用DNAStar 软件将GenBank 中下载的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因的核苷酸序列进行比对，分别对三种目的基因进行特异性保守区域的筛选，采用Primer6.0 和Oligo6.0 软件设计特异性引物，并通过NCBI BLAST 在线验证其特异性，筛选出分别针对三种目的基因的3 对特异性引物。设计出的引物序列见表1。上述引物均由赛默飞广州分公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA 的提取与RNA 的反转录参照试剂盒使用说明书，运用 DNA/RNA 抽提试剂盒对试验中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV和MDV 的DNA/RNA 进行抽提，并用33μL DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。参照反转录酶说明书对RNA 病毒的抽提产物进行反转录合成cDNA，所有产物置-30℃保存。

1.2.3 三重RT-PCR 反应体系及条件的优化该方法的PCR 反应体系为25μL：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL，作为模板ChPV DNA 和H9亚型AIV cDNA 各加入1μL，再分10 个梯度各加入0.1～1.0μL 对引物ChPV-F 、ChPV-R、H9-F、H9-R、M-F 和M-R (25pmol/μL)进行浓度的优化，最后用超纯水将反应总体积补足至25μL。为最终确定最佳的反应体系及条件根据实验效果对退火温度及时间进行优化。

1.2.4 特异性试验为验证所建立的三重RTPCR 检测方法的特异性，运用该法将H1N2、H2N3、H3N2、H5N1、H6N2、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、NDV、IBV、ARV、ILTV、ChPV、Adv4、RTV、aMPV、CAV、AHEV 和MDV 的RNA/DNA 按照优化好的反应条件进行检测。对扩增出的目的片段进行纯化回收，连接到载体pMD18-T 上并转化到感受态细胞（DH5α）中进行克隆，挑选阳性单克隆菌送赛默飞广州分公司进行测序验证。

1.2.5 标准品的制备分别以ChPV DNA 与H9N2亚型AIV cDNA 为模板，用特定的引物对ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9N2亚型AIV HA基因的全长片段进行PCR 扩增，得到其ChPV NS基因、M 基因和HA 基因的全长目的片段，再分别将这三个基因片段连接到pMD18-T 的载体中并转化到感受态细胞（DH5α）中进行克隆，挑选阳性单克隆菌送赛默飞广州分公司进行测序验证。将含有ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV的HA 基因片段的3 种重组质粒分别命名为NST、M-T 和H9-T。用质粒抽提试剂盒提取NS-T、M-T 和H9-T 的质粒，并用微量核酸检测仪对其进行核酸浓度的测定，根据分子质量和核酸浓度计算对应的拷贝数，将NS-T、M-T 和H9-T 等拷贝数混合，并进行10 倍倍比稀释，以得到NS-T、MT 和H9-T 质粒DNA 浓度均为5×109～5×101拷贝/μL 的标准品。

1.2.6 敏感性试验为检测该方法的敏感性，运用所建立的ChPV、AIV M 基因和H9亚型禽流感病毒三重RT-PCR 的检测方法对NS-T、M-T 和H9-T 质粒浓度为5×107～5×102拷贝/μL 的样品进行特异性扩增。

1.2.7 临床样品检测对活禽市场采集的130 份鸡咽喉及泄殖腔拭子运用建立的三重PCR 检测方法进行检测鉴定，同时将病料处理后接种SPF鸡胚进行病毒分离鉴定，并进行HA 基因全长扩增。同时经ChPV NS 基因阳性PCR 产物和HA 基因全长克隆送测序公司进行测序，然后将上述结果进行比较，验证三重RT-PCR 的检测结果。

2.2 结果与分析

2.2.1 三重RT-PCR 条件的优化通过对ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因3 种引物浓度的测定及扩增温度时间等的优化，最终确定三重PCR 最佳反应体系：2×TransTaq-T PCR SuperMix 12.5μL，ChPV DNA 和H9亚型AIV cDNA 各1μL 作为模板，引物H9-F 和H9-R(25pmol/μL)各加入0.5μL，引物ChPV-F 和ChPVR(25pmol/μL)则分别加入0.8μL，引物M-F 和M-R(25pmol/μL)则分别加入0.8μL，最后用超纯水补足至25μL。最终优化的反应条件为：95℃5min；进入95℃ 30s，56℃ 45s，72℃ 45s，共35 个循环；然后再72℃延伸10min，最后4℃结束反应。

2.2.2 特异性试验该法对ChPV 及H9亚型AIV混合感染样品能检测出3 条特异性的条带，分别为551bp （ChPV）、249bp （AIV M 基因通用）及378bp（H9亚型）；对ChPV 检测结果仅出现1 条特异性条带，片段大小为551bp；对H9N2与H9N6亚型AIV 进行扩增检测出2 条特异性条带，片段大小分别为378bp 和249bp；对其他亚型AIV 出现1条特异性249bp 条带，其它常见的禽病病原体均未扩增出任何条带，结果表明该方法具有良好的特异性。特异性结果见图1。

2.2.3 敏感性试验运用该方法针对5×107～5×102拷贝/μL 的ChPV NS、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因的质粒模板进行扩增，结果显示，对浓度为5×107～5×104拷贝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因质粒均可扩增出3 条明显的特异性条带，片段大小分别为551bp、249bp 和378bp；对浓度等于或小于5×103拷贝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因质粒均无扩增条带。由此可见，该法最低能检测到5×104拷贝/μL 的ChPV NS 基因、AIV M 基因和H9亚型AIV HA 基因质粒。敏感性结果见图2。

2.2.4 临床样品检测运用该方法对广西兽医生物技术重点实验室从南宁活禽市场采集的130 份鸡口腔及泄殖腔的棉拭子样品进行了检测，检测结果显示：有2 份样品能同时扩增出551bp、249bp和378bp 的目的条带，为ChPV 和H9亚型AIV 混合感染阳性；有6 份样品能同时扩增出378bp 和249bp 的目的条带，为H9亚型AIV 单一感染阳性；13 份样品仅能扩增出551bp 的目的条带，为ChPV单一感染阳性；3 份样品仅能扩增出249bp 的目的条带，为除H9亚型外的H3和H6亚型AIV 感染。同时对上述样品进行病毒分离鉴定和HA 基因测序，其结果与三重PCR 检测结果100%相符，说明该方法具有一定的实用性。部分临床样品检测结果见图3。

3 讨论

研究表明，鸡的肠道性疾病例如病毒性腹泻给养鸡业造成了严重的经济损失，其中引起鸡肠炎及腹泻等症状ChPV 在临床上也经常检出[17]。另外，在出现神经症状和活动障碍的肉鸡群中也检测到ChPV 感染，临床还存在ChPV 隐性感染或者与其它病毒及细菌混合感染的情况，进而引起生长发育受阻，出现“僵鸡”及饲料料肉比下降等[18]。另外由于ChPV 引起的临床症状与其它病毒较相似，且在临床上极易呈现出混合感染的病例，给临床上鉴别诊断带来困难。研究还发现ChPV 具有垂直传播的潜在可能，可能造成种蛋的孵化率下降及鸡胚发育吸收不良的情况增加。ChPV 疫苗研发的最大障碍是其在细胞和鸡胚上不能大量增殖，现在还没有有效的商品化疫苗防治ChPV 感染。目前，国内虽然没有关于ChPV 暴发和流行的相关报道，但是本实验室在对广西地区不同品种和日龄鸡群监测的结果表明ChPV 在某些品种和日龄鸡群的感染率依然很高。因此，对于ChPV 的监测及防控也是十分迫切和必要的，建立一种快速的鉴别诊断方法可以为该病的监测及防控提供有力的技术支撑。

H9亚型禽流感是目前对家禽养殖业危害最为严重的疾病之一，其在全球各个地方均有发生，而H9N2亚型AIV 在我国鸡群中流行最为广泛。 H9N2亚型AIV 可以跨越种属屏障直接感染人类，严重威胁人类公共健康的安全。 AIV 基因组由8 个独立节段组成，分别为HA、NA、M、PB1、PB2、PA、NP和NS[19]。由于AIV 抗原在自然条件容易发生变异，临床上易导致新的AIV 亚型出现，而且会发生多种亚型AIV 的混合感染，其引起的症状又极其相似，给精确鉴别诊断造成了巨大的困惑。在AIV的所有基因片段中，HA 基因的变异最频繁，同时也是变异最大的，因此HA 基因的分型鉴定引物根据其变异而不断的进行更新。 M 基因因其保守性更强，经常被用来设计AIV 通用引物。

由于经典的病毒分离鉴定方法存在检测鉴定禽流感病毒的周期较长，而常用的血清学方法则需要较多不同亚性标准阳性血清且不同亚型血清之间的抗原存在不同程度的血清学交叉反应，因此这些传统检测方法均存在不同程度的局限性。分子生物学特别是PCR 检测方法对AIV 进行鉴定与分型目前最常用的检测方法，也是WHO 与OIE 推荐的方法之一[20]。该方法快速准确、操作简便、平均样品检测成本相对较低，得到了广泛的认可与应用推广。近年来，国内外已有检测ChPV 和AIV 的PCR 诊断技术和方法的研究，而且多重PCR 技术在不同禽病混合感染诊断中的应用越来越多[21-24]。本研究建立H9亚型AIV 与ChPV 三重PCR 检测方法可以快速诊断和鉴别H9亚型AIV或者ChPV 单独和混合感染。我们建立方法的特异性试验结果显示，多种亚型AIV 和ChPV 混合感染时依然能特异扩增出目的基因的条带；敏感性试验的结果表明，当两种病毒混合感染时，该方法依然能够清晰扩增出两种病毒的目的基因片段；临床试验结果说明建立的H9亚型AIV 和ChPV 三重PCR 检测方法能够直接进行临床样品的检测，为临床上两种不同疾病的快速鉴别和诊断提供了良好的技术支撑。