miR-370-3p靶向HDAC4调节卵巢癌SKOV3细胞的生长和代谢研究

武红 李枫 张曦辉 王军 张占薪

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是一种常见的恶性妇科肿瘤，在世界范围内死亡率较高［1］。因缺乏有效的筛查策略，近70%患者于中晚期时才被诊断出OC，导致5年生存率相对较低［2］。尽管针对OC 的手术和化疗已有很大改善，但总体生存率仍较低［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）是源自内源染色体的非编码RNA，其由15～22 个核苷酸组成，在OC 中miRNA 的异常表达起着促癌或抑癌作用［4］。其中miR-370-3p 在结肠癌、胆管癌、神经胶质瘤、甲状腺癌和膀胱癌等中起抑制作用［5］。研究表明，miR-370通过对内皮糖蛋白（endoglin，ENG）的负调控抑制子宫内膜样OC 的增殖，促进子宫内膜样OC 对顺铂（cisplatin，cDDP）的化学敏感性［6］。本文旨在研究miR-370-3p 对OC 细胞的生长和代谢的作用及机制，以期对OC诊断和治疗的潜在靶点进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 选取2017年2月至2019年2月23例于郑州人民医院行OC切除术患者的组织标本，年龄29～63岁，根据FIGO分期标准（2014年）分为Ⅰ期1例、Ⅱ期10例、Ⅲ期11例、Ⅳ期1例。本研究通过本院研究伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.1.2 细胞和裸鼠 正常卵巢上皮细胞系HOSEpiC和5 种OC 细胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、CaOV-3和A2780均购自上海素尔生物科技有限公司，所有细胞在含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和100 Ug/mL 的链霉素的RPMI 1640 培养基中，温度37℃、5%CO2条件下培养。12 只裸鼠购自四川夏派森医药科技有限公司［许可证：SYXK（川）2017-203］，在温度（25±3）℃，湿度60%，白天/夜晚各12 h，并自由采食的条件下饲养，分为对照组、miR-370-3p模拟物组、pc-HDAC4 组、miR-370-3p 模拟物+pc-HDAC4组，每组3只。

1.1.3 主要试剂 miR-NC、pc-NC、miR-370-3p 模拟物、pc-HDAC4质粒和实验所用各种引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。RPMI 1640培养基购自上海慧颖生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒购自上海易色医疗科技有限公司；胎牛血清、青霉素和链霉素双抗溶液购自上海素尔生物科技有限公司；miRNeasy 试剂盒购自南京新科元生物技术有限公司；cDNA 逆转录试剂盒Prime Script RT Master Mix 购自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBR-Green PCR 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗和Ki-67、PCNA、裂解caspase3、Bax、HDAC4、3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔来源的单克隆抗体一抗购自上海艾博抗生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自上海恪敏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测 使用miRNeasy试剂盒从组织和细胞系中提取总RNA。使用PrimeScript RT Master Mix Kit将mRNA反转录为cDNA，并按SYBR-Green PCR试剂盒说明扩增并检测mRNA。引物序列：U6上游为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-370-3p上游为5′-TAGCGGGTTTTGCTAGGGC-3′，下游为5′-TAGC GCCTAGGGCATCGATC-3′；HDAC4 上游为5′-AGCGT CCGTTGGATGTCA-3′，下游为5′-GGGCAAGGATGGC GATGT-3′。使用2-ΔΔct方法，计算mRNA的相对表达量。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔCt（标准基因）-ΔCt（目的基因）。

1.2.2 细胞转染 取对数期细胞，加入1×106/mL 细胞液0.1 mL/孔，接种于6 孔板。达到80%融合时，根据Lipofectamine 2000 说明书将100 μL 的miR-NC、pc-NC、miR-370-3p 模拟物、pc-HDAC4 质粒分别或联合转染进入SKOV3细胞。

1.2.3 双荧光素酶试验 将1 μg萤火虫荧光素酶报告基因构建体HDAC4野生型（WT）或PGL3-HDAC4-突变型（MUT）以及miR-370-3p模拟物或miR-NC和PRLCMV 海藻荧光素酶报告质粒转染细胞转染48 h 后，SKOV3细胞裂解15 min，双荧光素酶试验检测系统测量荧光素酶的相对活性。

1.2.4 蛋白印迹法检测 使用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。经SDSPAGE 分离蛋白，用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜，然后脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，加入一抗在4℃封闭过夜，再加入对应二抗室温封闭1 h，滴电化学反应液曝光。以GAPDH 为内参，使用Quantity One 软件进行分析蛋白条带灰度。

1.2.5 CCK-8检测 加入1×106/mL细胞液0.1 mL/孔，接种于96 孔板中，于5%CO2、37℃培养箱中培养24 h，加入CCK-8溶液10 μL/孔，于5%CO2、37℃培养箱中培养2 h。使用酶标仪在450 nm 波长下测量每个样品的吸光度。

1.2.6 流式细胞术检测 按照1×106/mL的细胞浓度重悬。细胞悬液中加入5 μL 的Annexin-V-FITC 和5 μL 的PI，避光孵育15 min，使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.2.7 Seahorse XF24 检测 加入1×106/mL 细胞液0.1 mL/孔，接种在Seahorse 平板中，孵育过夜，并在Seahorse 缓冲液中洗涤。在培养期间的不同时间中分别加入175 μL的Seahorse缓冲液，其中含10 mmol/L葡萄糖、1 μmol/L 寡霉素和100 mmol/L 2-DG 缓冲液测定细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），含1 μmol/L寡霉素、1 μmol/L碳酰氰-4-三氟甲氧基苯腙（FCCP）和1 μmol/L鱼藤酮缓冲液测定氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）。葡萄糖处理后的ECAR 表明糖酵解速率，寡霉素处理后的ECAR表明其糖酵解能力，寡霉素处理前的耗氧量为基础呼吸率，FCCP处理后的耗氧量为最大呼吸速率。

1.2.7 移植瘤免疫组织化学法检测 在各组裸鼠左腋皮下注射0.5 mL 转染慢病毒SKOV3 细胞，浓度为5×104/mL。第30 天颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤，测定移植瘤体积和重量。对移植瘤组织进行免疫组织化学法检测，石蜡包埋，脱蜡水化，过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清阻断非特异性反应，分别加入一抗Ki-67 和caspase-3 单克隆抗体，4℃过夜，滴加生物素标记二抗，DAB 显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片观察统计。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。定性资料采用表达，Shapiro-Wilk 检验数据是否符合正态分布。采用One-Way ANOVA分析进行多组比较，采用SNK检验进行两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 OC 组织和细胞中miR-370-3p 和HDAC4 表达量

RT-qPCR检测结果表明，与正常组织相比，OC组织中的miR-370-3p mRNA 相对表达量显著下调，HDAC4 mRNA 相对表达量显著上调（P＜0.01）；与HOSEpiC相比，OC细胞系中的miR-370-3p mRNA相对表达量显著下调，HDAC4 mRNA相对表达量显著上调（P＜0.01，图1）。

2.2 SKOV3细胞中miR-370-3p和HDAC4靶向关系

选择SKOV3细胞进行以下实验。RT-qPCR检测结果表明，与miR-NC组相比，miR-370-3p模拟物组的miR-370-3p mRNA表达水平显著上调（P＜0.01）。蛋白印迹法检测结果表明，与对照组相比，miR-370-3p模拟物组的HDAC4蛋白表达显著下调（P＜0.01），pc-HDAC4组的HDAC4蛋白表达显著上调（P＜0.01）；与miR-370-3p模拟物组相比，miR-370-3p模拟物+pc-HDAC4组的HDAC4蛋白表达显著上调（P＜0.01）。Targetscan软件预测miR-370-3p与HDAC4在3’UTR区存在结合位点，通过双荧光素酶试验发现，miR-370-3p与HDAC4-野生型共转染显著降低荧光素酶活性（P＜0.01），miR-370-3p靶向下调HDAC4（图2）。

图1 OC组织和细胞中的miR-370-3p和HDAC4相对表达量

图2 SKOV3细胞中miR-370-3p和HDAC4靶向关系

2.3 miR-370-3p对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

CCK-8、蛋白印迹法和流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，miR-370-3p模拟物组的细胞增殖显著下调，细胞凋亡显著上调，PCNA和Ki-67蛋白表达显著下调，裂解caspase-3 和Bax 蛋白表达显著上调（P＜0.01），而pc-HDAC4 组的SKOV3 细胞增殖显著上调，细胞凋亡显著下调，PCNA和Ki-67蛋白表达显著上调，裂解caspase-3 和Bax 蛋白表达显著下调（P＜0.05 和P＜0.01）。与miR-370-3p 模拟物组相比，miR-370-3p 模拟物+pc-HDAC4 组的细胞增殖显著上调，细胞凋亡显著下调，PCNA和Ki-67蛋白表达显著上调，裂解caspase-3和Bax蛋白表达显著下调（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制SKOV3细胞增殖并促进细胞凋亡（图3）。

2.4 miR-370-3p 对SKOV3 细胞糖酵解能力和线粒体功能的影响

Seahorse XF24检测结果表明，与对照组相比，miR-370-3p模拟物组的SKOV3细胞糖酵解速率和糖酵解能力显著下调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著上调（P＜0.01），而pc-HDAC4组的SKOV3细胞糖酵解速率和糖酵解能力显著上调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著下调（P＜0.01）。与miR-370-3p模拟物组相比，miR-370-3p模拟物+pc-HDAC4组的SKOV3细胞糖酵解速率和糖酵解能力显著上调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著下调（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制SKOV3细胞代谢（图4）。

2.5 miR-370-3p对SKOV3移植瘤的影响

免疫组织化学法和Seahorse XF24检测结果表明，与对照组相比，miR-370-3p模拟物组的SKOV3移植瘤体积和重量显著下调，Ki-67阳性细胞比率显著上调，caspase-3阳性细胞比率显著下调，糖酵解速率和糖酵解能力显著下调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著上调（P＜0.01）；pc-HDAC4组的SKOV3移植瘤体积和重量显著上调，Ki-67阳性细胞比率显著下调，caspase-3阳性细胞比率显著上调，糖酵解速率和糖酵解能力显著上调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著下调（P＜0.01）。与miR-370-3p模拟物组相比，miR-370-3p模拟物+pc-HDAC4组的SKOV3移植瘤体积和重量显著上调，Ki-67阳性细胞比率显著下调，caspase-3阳性细胞比率显著上调，糖酵解速率和糖酵解能力显著上调，基础呼吸速率和最大呼吸速率显著下调（P＜0.01）。miR-370-3p靶向HDAC4抑制移植瘤生长（图5）。

图5 miR-370-3p对SKOV3移植瘤的影响

3 讨论

本研究表明miR-370-3p 过表达抑制OC 的发展，与Li等［7］研究相一致。研究表明，miR-370-3p通过抑制PDLIM1/Wnt/β-catenin 信号来抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖和诱导细胞凋亡［8］。另有研究发现，HDAC4是Ⅱ类组蛋白脱乙酰基酶，其表达在不同组织和器官中具有差异性，在肿瘤的发展和预后中具有重要作用。在食管癌中，HDAC4 过表达与生存不良相关，并促进肿瘤进展［9］，且HDAC4 通过p21 抑制胃癌SGC-7901 细胞的增殖并抑制细胞凋亡［10］。miR-520b 通过靶向HDAC4 抑制肺癌细胞生长［11］。在本研究的OC 组织和细胞中，miR-370-3p 低表达、HDAC4 高表达，miR-370-3p 靶向下调HDAC4 表达；miR-370-3p过表达减少细胞增殖、增加细胞凋亡，下调PCNA 和Ki-67蛋白表达，裂解caspase-3和Bax 蛋白表达。表明miR-370-3p 通过靶向下调HDAC4 抑制OC细胞增殖，并诱导细胞凋亡。

为了满足癌细胞增殖的能量需求，细胞代谢模式从线粒体呼吸转变为有氧糖酵解［12］。研究表明，肌肽通过线粒体呼吸和糖酵解途径抑制人胃癌SGC-7901细胞的增殖［13］。并且除了通过改变代谢影响细胞增殖外，还有利于避免细胞凋亡［14］。miR-422a 过表达通过靶向胃癌中的丙酮酸脱氢酶激酶2 降低糖酵解能力并增强呼吸能力，抑制胃癌的恶化［15］。本研究中的miR-370-3p 过表达，降低OC 细胞的糖酵解速率和糖酵解能力，并升高基础呼吸速率和最大呼吸速率，表明miR-370-3p通过靶向下调HDAC4调节OC细胞的代谢。

综上所述，miR-370-3p 通过靶向下调HDAC4，抑制OC 细胞的生长，并改变OC 细胞的代谢。这说明miR-370-3p和HDAC4可成为治疗和预防OC的潜在靶点。本研究仅对相关机制进行了初步探讨，更为详细的分子通路机制还有待进一步深入研究。