莱茵衣藻纤毛内运送蛋白IFT57 抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

2020-01-19韩鹏飞樊振川

食品与生物技术学报 2019年11期

韩鹏飞，闫珍，樊振川*

（1. 天津科技大学大健康生物技术研究所天津300457；2. 天津市大健康生物技术国际联合研究中心天津300457；3. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一种单细胞真核藻类，它属于绿藻门（Chlorophyceae），等鞭毛纲（Isokontae），团藻目（Volvocales），衣藻属（Chlamydomonas）。衣藻属约100 多种，其中莱茵衣藻在遗传学方面研究得较为全面[1]。其细胞一侧具有两条等长的纤毛，赋予莱茵衣藻游动的能力[2]。纤毛是由细胞微管为主构成的，一种细胞表面突起的亚细胞结构。纤毛的进化非常保守，广泛分布于原生生物到脊椎动物的真核细胞的细胞表面[3]。

“鞭毛内运输”（intraflagellar transport，简称IFT）是发生于纤毛轴丝和纤毛膜之间，由IFT 蛋白颗粒的两个亚蛋白复合物IFT-A 和IFT-B，经其不同偶联的马达蛋白作用，从纤毛基部到顶端的一种蛋白质复合体的双向运输过程[4-6]。 IFT 对纤毛的组装、维持和解聚起到决定性作用。纤毛具有极高的复杂性，在调控繁多的细胞生理活动和复杂的动物发育过程中具有重要作用。纤毛亚基蛋白IFT-A 和IFT-B 的突变，会引起纤毛运动性的丧失或纤毛的缺陷，从而导致人类出现肥胖、糖尿病、内脏转移、多囊肾病、色素性视网膜炎、复性呼吸道感染、不育症、智力迟钝、多趾等症状[7]。因此，研究IFT 蛋白颗粒复合物相关作用对纤毛病的发病机理和预防显得尤为重要。

最近，生物学研究发现IFT-B 由两个亚基复合物IFT-B1 和IFT-B2 构成，IFT-B2 中的蛋白IFT57位于IFT-B1 和IFT-B2 之间[8-9]。 IFT57 是与运动有关的蛋白质，IFT57 在鞭毛内运输中起到阻止IFT颗粒复合物降解的功能，在鞭毛组装中发挥着重要作用，它的缺失会导致纤毛的缺陷，影响细胞的游动[10]。因此，制备莱茵衣藻IFT57 抗体，为进一步研究其维持纤毛长度和功能提供了前提。

原核表达系统具有表达量高、培养成本低、方法简单、稳定性好等优点，利用该系统表达蛋白质、制备抗体已经相当成熟[11-12]。作者利用该系统表达ift57基因中一段编码亲水性氨基酸序列的片段，进行蛋白质的亲和纯化和抗原抗体的反应，比表达全基因序列具有快捷、高效、经济的优势，为原核表达一系列溶解性差、高相对分子质量、难纯化蛋白质提供了一定的借鉴意义。为深入研究IFT57 在鞭毛内运输中的作用机理，为营养代谢纤毛病的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌（Escherichia coli）XL1-blue，BL21（DE3）感受态细胞，pET-28a（+）质粒：均为作者所在实验室保存；莱茵衣藻CC-125 藻种：为作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂限制性内切酶、TransTaqHiFi DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶和彩色预染蛋白Marker等：均购自美国Fermentas 公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、NC 膜：购自北京索来宝公司；DNA Marker（1000 bp、100 bp）、dNTPs：购自全式金公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow 蛋白质纯化介质以及Protein A SepharoseTMCL-4B 抗体纯化介质：均购自美国GE Healthcare 公司；弗式完全佐剂和不完全佐剂：购自美国Sigma 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG 抗体：购自美国Cell Signaling 公司。

1.1.3 实验动物新西兰大白兔1 只，两月龄大，体重1.5 kg，由天津欧阳实验种兔场提供。

1.2 方法

1.2.1 IFT57 蛋白质亲水性分析运用DNAMAN软件对IFT57 表达蛋白质进行亲水性分析，见图1。选取N 端319~469 aa 作为抗原，在大肠杆菌中进行表达[13]。

图1 IFT57 表达蛋白质的亲水性分析Fig. 1 Hydrophilic analysis the expressed of IFT57 protein

1.2.2 原核表达载体构建作者所在实验室保存的pET-28a （+）表达载体用BamHI、HindIII 进行双酶切，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收；根据引物设计原则设计带有BamHI 和HindIII 酶切位点的PCR 引物，上游引物5’-TAGGATCCATGGTGAT CAGCA AGGCCTGG-3’，下游引物5’-ACAAGCTT TCA CTA GTCCTCCTCCTCGTCG-3’。通过菌落PCR 扩增目的片段，利用产物纯化试剂盒回收扩增产物。用BamHI、HindIII 进行双酶切，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的基因；将目的基因与载体用T4DNA 连接酶连接后，转化到大肠杆菌XL1-blue 中，涂到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上；挑选阳性菌落进行培养，提取重组质粒，进行酶切和测序验证。

1.2.3 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达验证将验证正确的重组质粒用热激法转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 平板上筛选含pET-28a（+）-ift57质粒的阳性菌落；挑取阳性菌落于LB 液体培养基（含50 μg/mL 卡那霉素）过夜培养，然后按照1∶20 接种体积分数转接扩大培养到含卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培养基中，37 ℃、225 r/min 培养至OD600值到0.6~0.8，加入终浓度0.2 mmol/L 的IPTG，28 ℃、200 r/min 诱导表达6 h，同时设置不加IPTG 对照组。离心收集菌体并进行超声破碎，分别取未诱导、全蛋白质、上清液和沉淀与2×蛋白质上样缓冲液混合煮沸，用12 g/dL SDS-PAGE 电泳检测蛋白质表达情况。

1.2.4 融合蛋白质6×His-IFT57 的纯化诱导表达后的菌体加入15 mL His Bingding buff （20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），超声破碎菌体细胞至澄清，离心（4 ℃，12 000 r/min，15 min）收集上清液，经过0.45 μm 滤膜过滤后加入到预先平衡好的Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 纯化柱中，经过常温结合、洗涤和洗脱等步骤得到纯化后的目的蛋白质。纯化条件为：常温结合1 h，洗涤缓冲液A（20 mmol/L咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），洗脱缓冲液A（500 mmol/L 咪唑，20 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），将上述收集的流穿液组分、洗涤组分以及洗脱组分分别用12 g/dL SDS-PAGE检测分析，利用酶标仪，结合标准曲线测定融合表达蛋白质浓度[14]。通过不断优化所用溶液的pH、盐离子浓度、咪唑的含量等条件得到了纯度较高的融合蛋白质。

1.2.5 多克隆抗体的制备实验动物是两月龄大的新西兰雄性大白兔，适应一周后进行第一次免疫。初次免疫前在耳源静脉取血，分离血清，在后续试验中作为阴性血清[15-16]；取1 mg 纯化后的融合蛋白质与同剂量弗氏完全佐剂混合后充分乳化，采用颈背部皮下多点注射法免疫实验动物；之后每隔10～14 d 取1 mg 6×His-IFT57 蛋白质与同剂量的弗氏不完全佐剂进行乳化，加强免疫大白兔，每次加强免疫前进行耳源取血，利用间接ELISA 法测定抗血清的效价，当效价满足试验要求，加强免疫后一周取血分离抗血清，分装冻存[17-18]。

1.2.6 间接ELISA 法测定抗血清效价本实验采用间接ELISA 法测定抗血清的效价，以6×His-IFT57 蛋白质作为包被抗原，用5%的脱脂乳粉封闭后，以所得的抗血清为一抗，抗血清和阴性血清设定稀释梯度1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000，二抗为HPR 标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000），经过TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺）显色并经0.5 mol/L H2SO4终止，测定OD450处的吸光值，对照实验组血清OD450与阴性组血清OD450的数值，确定抗血清的效价[19]。

1.2.7 抗血清的纯化分离完的抗血清用Protein A SepharoseTM进行纯化，纯化条件为[12]：结合缓冲液B（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脱缓冲液B（0.1 mol/L 甘氨酸，pH 2.7）。收集洗脱液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）将洗脱液pH 值调至中性，进行后续Western blotting 检测。

1.2.8 Western blotting 检测多克隆抗体的特异性将处理好的莱茵衣藻CC-125 藻种进行蛋白质定量[20]，取8 μL（20 ng）衣藻上清液加入2 μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE 和电转印后，衣藻蛋白质转移到PVDF 膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h；多克隆抗体稀释度1∶500，二抗为HRP 标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000），加入显色液后曝光照相。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建及鉴定

PCR 扩增获得456 bp 片段，与预期大小一致，见图2（a）。将重组的质粒进行BamHI 和HindIII 双酶切验证，获得条带大小约为450 bp 左右的片段，与预期结果一致，见图2（b）。将重组质粒送到金唯智公司测序，经过测序验证后序列完全正确，说明表达载体构建成功，表达质粒结构正确，并将其命名为pET-28a（+）-ift57。

图2 ift57 的PCR 扩增和重组表达载体的双酶切验证Fig. 2 PCR amplication of ift57 and identification of recombinant expression plasmid by restriction enzyme digestiond

2.2 融合蛋白质的诱导表达及可溶性分析

pET-28a （+）-ift57转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，菌体经过0.2 mmol/L IPTG 诱导（同时设置不含IPTG 的对照组），经过SDS-PAGE 在17 200处出现目的条带，对照组菌体蛋白质没有此带，说明目的蛋白质6×His-IFT57 成功表达，见图3（a）；将诱导完的菌体经过超声破碎，取全蛋白质和上清液以及沉淀，经过SDS-PAGE 发现，目的条带主要出现在上清液中，而沉淀中则几乎没有，说明融合蛋白质呈水可溶性，见图3（b）。

图3 SDS-PAGE 检测重组蛋白质在E. coli BL21（DE3）中的表达Fig. 3 SDS -PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21（DE3）

2.3 融合蛋白质的纯化

融合蛋白质6×His-IFT57 经过His 亲和层析纯化后，用SDS-PAGE 进行分析。结果表明，融合蛋白质的相对分子质量大小正确，且纯度达95%以上，见图4。

2.4 抗血清效价的测定

用纯化得到的6×His-IFT57 融合蛋白质作为抗原免疫新西兰大白兔，第五次免疫后经耳缘静脉少量采血，室温静置1 h 后获得析出血清，以间接ELISA 法测定抗血清的效价，利用酶标仪测定OD450处的吸光值后计算出抗血清的效价，结果见图5。可知，新西兰大白兔抗血清效价大于512 000。

图4 经Ni SepharoseTM 6 Fast Flow 纯化后6×His-IFT57融合蛋白质的SDS-PAGE 检测Fig. 4 SDS-PAGE analyzed the purified 6×His-IFT57 recombinant protein

图5 间接ELISA 法测定抗血清的效价Fig. 5 Results of ELISA test of anti-IFT57 polyclonal antiserum

2.5 Western blotting 抗体特性检测

于第五次免疫后一周取兔子血分离抗血清。将抗血清首先经过Protein A 纯化，再进行抗原-抗体膜纯化。用Western blotting 检测其识别莱茵衣藻中IFT57 蛋白质的特异性，经过显色可以在57 000 附近识别出单一条带，条带相对分子质量大小符合预期，见图6。即制备的多克隆抗体可以特异性识别IFT57 蛋白质，可以直接用于后续对IFT57 的研究。

3 结语

目前对纤毛的结构、组装机制、功能的研究和对“纤毛相关疾病”相关机理的了解主要来自于对莱茵衣藻、四膜虫（Tetrahymean）、锥体虫（Trypanosome）、线虫（C. elegans）、斑马鱼（Brachydaniorerio）和小鼠（Musmusculus）等各种模式生物的研究。莱茵衣藻以其特有的细胞培养优势、实验系统优势、生化研究优势和经典遗传优势等成为研究最广的一个[21]。目前，对纤毛的研究起步较晚，我们对“纤毛内运输”调控机制、马达蛋白的活性调剂，以及纤毛解聚和细胞周期之间的相互关系等认识有限，对“纤毛相关疾病”的发病机理的研究，以及对该类病的预防、诊断和治疗还有一定差距[21-22]。因此，继续对“纤毛内运输”中不同蛋白质颗粒的研究，将会给这些问题带来答案，对“纤毛相关疾病”机理的研究和预防治疗，带来一定的理论基础和指导意义。

本研究的ift57基因，虽然在对纤毛的形成中不起重要作用，但是在阻碍纤毛降解过程中发挥重要作用，从而避免了纤毛的缺失[10]。为进一步研究ift57基因对纤毛缺失的影响，我们制备了高特异性和高灵敏度的抗体。作者利用大肠杆菌，经原核表达系统表达ift57部分亲水性序列，采用小标签His 纯化标签和目的蛋白质融合表达出纯度极高（95%以上）的可溶性蛋白质，作为抗原免疫动物获得相应抗血清。该抗体灵敏度强、特异性高，仅经过一步纯化便可以经过ECL 曝光，充分验证其特异性和灵敏度。该方法极大的节省了融合蛋白质纯化和抗血清纯花步骤，带来了一定经济效益。该方法为多克隆抗体的制备提供了一种新型手段，为大相对分子质量、水不溶性蛋白质的纯化提供了借鉴意义。该抗体的制备为ift57 在纤毛运输的作用机制和有关纤毛病的研究提供了有利的支持。