衣藻二氧化碳浓缩机制及其调控的研究进展

秦燕 范波 苗贵东

摘要 当低浓度CO2限制微藻光合作用时，CO2浓缩机制（CCM）是一种有效的无机碳（Ci）吸收策略，以保证微藻的正常生存和繁殖。CCM主要是通过升高1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）附近的CO2浓度增强光合作用的效率，同时抑制光呼吸的进行。CCM的关键步骤包括无机碳的聚集吸收、Rubisco对CO2的固定和碳酸酐酶催化的不同Ci的转换。CCM中分子调控元件的有序协作，不仅可以帮助细胞感知周围CO2的浓度，诱导调节CCM基因的表达，还可以协调衣藻在低浓度CO2环境下光合作用中碳和其他代谢途径的相互作用。总结了目前以衣藻作为模式生物对真核藻类CCM的研究概况、调控机理，以及CCM机制在农业方面的应用和展望。

关键词 衣藻;二氧化碳浓缩机制;调控机理;无机碳吸收系统

中图分类号 Q949.21  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）04-0020-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.006

Research Progress on the CO2 Concentrating Mechanism and Its Regulation in Chlamydomonas

QIN Yan，FAN Bo，MIAO Gui-dong （College of Biology and Chemistry，Xingyi Normal University for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400）

Abstract CO2 concentrating mechanism （CCM） is an effective way for carbon assimilation that enables microalgae to survive and proliferate in the limiting CO2 concentration.CCM can improve the CO2 concentration near the Rubisco to enhance the photosynthetic efficiency and suppress the photorespiration.The key components of CCM include inorganic carbon （Ci） uptake，Ci fixation by Rubisco and the interconversion of different Ci catalyzed by CA.An array of the molecular regulatory elements can facilitate cells to sense the CO2 concentration，regulate the expression of the CCM and to coordinate the photosynthetic carbon metabolism and other metabolic processes in response to limiting CO2 conditions.This review summarized the current understanding of the eukaryotic algal CCM，based largely on chlamydomonas as a model organism，to illustrate how chlamydomonas adapts to the limiting CO2 and how its CCM was regulated.

Key words Chlamydomonas;CO2 concentrating mechanism;Regulation mechanism;Ci absorption system

基金項目

贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字〔2019〕221号）;兴义民族师范学院博士科研基金项目（18XYBS02）;黔西南州2019年州级科技计划自筹资金项目（2019-2-50）。

作者简介 秦燕（1980—），女，山东莱芜人，副教授，博士，从事细胞与分子生物学研究。

收稿日期 2020-07-11

光合作用中的碳代谢可称为地球上最重要的化学反应，地球上全部绿色植物的生长都离不开光合作用，是全球碳循环的关键环节。光合作用过程中核心的途径是卡尔文循环（CCB），此循环包含一系列的生化反应，通过这些反应无机碳（Ci）转化成有机碳，并将太阳能储存在碳水化合物中。CCB循环最初是在绿藻Chlorella和Scenedesmus中阐明的[1]。绿藻中的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）以其独特的优势，逐渐成为模式生物来研究生物学的热点问题，如光合作用、光合趋光性、鞭毛/纤毛生物学、藻脂生物学。因为衣藻是一种单倍体生物，生活周期短、遗传背景清楚，衣藻的光合作用结构、光合作用中的光反应和暗反应中碳的代谢与高等植物非常相似[2-5]，因此在衣藻中的很多发现可以直接适用于高等植物。衣藻作为一种生活在特殊环境中的单细胞生物，与其他藻类一样，有其独特和灵活的代谢特征和基因表达调控的独特机制，使其能够在外界条件波动极大的环境中生存下来[3-4，6-7]。

光合自养的生物已经进化出许多适应策略来应对周围各种不利的环境条件，其中一个例子就是CO2浓缩机制（CCM），这是蓝细菌和真核微藻为适应地球上古老大气中CO2浓度降低和O2浓度升高进化出来的一种响应机制。 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用过程中碳吸收的核心酶，它在CCB循环中催化第一步也是最重要的一步羧化反应，催化CO2与RuBP的结合，实现无机碳向有机碳的转化。Rubisco是一种古老的酶，进化中存在于高浓度CO2低浓度O2的环境中。目前大气中的CO2浓度远远低于Rubisco羧化酶的活性所需要的饱和浓度，大气中高比率的O2/CO2提高了Rubisco加氧酶的活性，这使其进入既消耗能量又释放CO2的光呼吸途径[8]。CCM机制则通过弥补Rubisco羧化酶效率低的特点，提高CO2浓度，增加光合作用的效率。目前在植物中已经进化出不同的策略提高Rubisco附近CO2浓度，增强Rubisco羧化酶的活性同时降低加氧酶活性，实现高效率的光合作用。这些策略出现在不同类群植物的不同发育阶段，包括高等植物中多样化的C4代谢途径和微藻、蓝细菌中多样化的CCMs[9-10]。

CCM与藻类植物光合作用、代谢活动、生长发育等方面密切相关，也是提高藻类生物量的关键因素。了解CCM可以更好地理解这些微观的生产者们是如何影响全球环境的，并可指导对藻类进行遗传和分子手段的操作，以提高其生物产量。对CCM机制的理解，还有助于实现人工设计将藻类特定特征引入到C3植物提高其光合效率[11-12]。蓝细菌的CCM已经在几个模式蓝细菌中得到广泛研究[13]。近几年，以衣藻作为真核光合模式生物，对CCM分子机制的理解也有了极大的进步。笔者主要是结合目前对衣藻CCM的理解及与无机碳吸收的相互作用，来总结衣藻是如何适应低CO2浓度的环境条件以及它的CCM是如何调节的。

1 CO2浓缩机制的概述

微藻CCM是基于单细胞的CO2浓缩机制，其依赖于多种无机碳吸收系统（图1）。这些无机碳吸收系统在细胞内形成以HCO3-为主的Ci库，库内的CO2浓度比水中的CO2浓度高1 000倍，这可能是目前已知最有效的Ci吸收系统[14]。CCM主要是通过升高Rubisco附近的CO2浓度增强光合作用的效率，同时抑制光呼吸的进行。

CCM是一种非常灵活调控的机制，可适应多种低浓度的CO2条件，通过不同的调控网络与其他生理过程协调，如光合作用、光呼吸中的碳代谢、细胞周期和昼夜节律等。微藻在多种低CO2浓度条件下发生了一系列的适应性反应，包括CCM基因的诱导表达、代谢活动的变化、生理的变化等。许多CCM研究将自然界的CO2浓度区分为2种生理状态：高CO2浓度状态（CO2 浓度1%～5%）和受限制的低CO2浓度状态（CO2浓度0～0.03%）。事实上，自然界存在多种CO2浓度的环境条件，如有的藻类生活在CO2浓度高的土壤中，有的生活在富含有机质的CO2浓度极低的水生条件。微藻在多种CO2浓度条件下的适应性研究都已被阐明，这反映了微藻可以适应多种自然生境条件。

2 衣藻中的二氧化碳浓缩机制

本质上讲，CCM的核心是活性Ci的吸收系统，而活性Ci的吸收包括HCO3-的跨膜运输、CO2的吸收、碳酸酐酶（CA）对不同状态Ci的转化和遗漏CO2的重新捕获。在衣藻中，Ci的吸收主要发生在质膜、叶绿体膜和叶绿体类囊体膜上[15]。通过转录组分析，确定了许多低CO2浓度条件下响应的基因如编码Ci的转运体、CO2吸收系统和CA（表1）。通过对CCM突变体的分子生物学研究，确定出许多Ci吸收的关键成分。在受限制的低CO2浓度条件下，不同的膜Ci转运体、CO2吸收系统和不同的CA参与了CCM的过程[14]（图2）。这些Ci吸收系统通过一系列调控元件的调控，从转录水平和翻译后水平2个层面调控基因的表达，使衣藻快速地适应不同的环境条件。

以下主要介绍了活性Ci如何从细胞外通过各种膜系统进入到类囊体基质中的过程，以及膜上和膜内有哪些Ci转运体蛋白参与了此过程。

2.1 细胞表面

在水生环境中，有CO2和HCO3-这2种无机碳形式。当CO2在液相和气相达到平衡时，溶解CO2的量取决于气相中CO2的分压，但是水中的CO2扩散速率比空气中慢104倍。水中CO2转化成HCO3-的速率依赖于pH。因为碳酸酐酶的解离常数（pKa值）接近6.4，在中性到堿性pH时，HCO3-占主导地位。为了保持细胞表面有足够多的HCO3-和CO2，需要大量有活性的HCO3-转运体或有活性的CO2吸收系统驱动大量的Ci流，这就需要有多个CA维持Ci的供应来保持HCO3-和CO2的平衡。CAH1是质膜外的碳酸酐酶，该蛋白在受限制的低CO2浓度条件下诱导表达，其功能可能是维持质膜HCO3-转运体运输的HCO3-的平衡或活性CO2吸收系统中CO2的平衡[16]。

2.2 穿越质膜

Ci进入细胞的第一道屏障是质膜。因为细胞膜对带电荷的Ci如HCO3-是不能通透的，所以Ci进入细胞需要膜上的Ci转运体的协助。 目前已经从衣藻中鉴定出2个HCO3-转运体HLA3和LCI1参与此过程。

HLA3是一种定位于质膜上的ABC转运体蛋白，含有ABC转运体特有的结构域，在衣藻和很多绿藻中都发现了HLA3转运体，该蛋白在CO2浓度低时发挥作用。ABC转运蛋白介导的HCO3-的吸收在蓝细菌中也有报道[13]。

LCI1是质膜上的另一个Ci转运体[17]。该蛋白有几个预测的跨膜结构域，但是未鉴定出具有功能的模体。如果在lcr1突变体中过表达LCI1可以在低CO2浓度下提高光合作用对Ci的亲和力，并能促进HCO3-的吸收[18]。此蛋白对Ci种类吸收的偏好性仍不清楚。与其他参与Ci吸收的蛋白不同，LCI1蛋白被认为是一种孤儿蛋白，即在与衣藻亲缘关系很近的物种（即使在团藻Volvox）中，没有确定出序列同源物，只在衣藻和其他几个绿藻基因组中预测出几个膜蛋白与该蛋白的空间结构相似。

2.3 细胞质内 目前仍不清楚胞质中哪些成分参与活性Ci的吸收以及Ci是否会在胞质中积累。如果胞质中Ci浓度低时，则需要CA的存在捕获更多的CO2。自然界中，CA一般分为α、β、γ 3类，目前从衣藻中已经鉴定出12个编码碳酸酐酶蛋白的基因CAs，包括3种α-CAs、6种β-CAs和3种γ-CAs，分别定位于线粒体（5个）、叶绿体基质（1个）、类囊体基质（1个）、胞质（1个）、壁膜间隙（3个），CAH7的定位仍然未知[19]。定位于胞质中的CAH9蛋白，其基因序列独特，与其他几种基因的序列差别较大，目前功能未知。定位于线粒体中的CAH4、CAH5，两者的核酸序列高度相似可达95%，均形成反向重复的结构[19]，这2个蛋白在受限制的CO2浓度下可被诱导大量表达，但这2个蛋白的功能未知，有可能不直接在CCM中发挥作用[20]。有研究发现如果将衣藻细胞从CO2浓度高的区域移动到CO2浓度低的区域，线粒体将会从中间位置移动到靠近质膜的位置，这种线粒体位置的移动可能是因为质膜上转运体的电荷发生变化引起的[21]。

2.4 穿越叶绿体膜

Ci吸收过程中的另一道障碍是叶绿体膜。有人从衣藻中分离出游离叶绿体，在叶绿体中观察到了活性Ci吸收的整个过程，并鉴定出许多叶绿体膜上的Ci转运体[17]。

LCIA是唯一确定参与低CO2浓度下跨叶绿体膜转运HCO3-的蛋白。在衣藻中，LCIA是一个主动运输的转运体，LCIA作为一种通道协助Ci进入叶绿体，其发挥功能需要与质膜上其他蛋白如HLA3或LCI1协同作用完成，它们共同将HCO3-逆着叶绿体膜上的电位转运至叶绿体内[15-22]。

叶绿体膜上还鉴定出CCP1和CCP2这2种Ci转运体，这2个叶绿体蛋白几乎完全相同，它们的序列与线粒体运载蛋白超家族高度相似[23]。但是有人推测此蛋白可能不参与Ci吸收[24]，认为或许CCP1/2的功能被掩盖[20]或者它们只是参与了适应低CO2浓度其他代谢物的转运[24]。有关CCP1/2在CCM中的功能需要更深入的研究。

叶绿体膜上另外一种膜蛋白CemA可能也是一种Ci转运体，它是质体ycf10基因的表达产物，ycf10基因的破坏会引起叶绿体中Ci吸收的降低[25]。此蛋白在蓝细菌中的同源物对于CO2的传递是必不可少的[26]。

2.5 叶绿体基质

叶绿体基质中有很多蛋白参与Ci的积累。LCIB是广泛分布于叶绿体基质中的蛋白质[15]，催化基质中CO2转化为HCO3-而保持基质中Ci的积累，此功能类似蓝细菌中ChpX和ChpY蛋白（也称为CupA和CupB）[27]。一般认为LCIB只在极低CO2浓度下发挥功能。在一些真核藻类和多种蓝细菌基因组中只发现一个LCIB的同源物[3，20，28]，可能LCIB是以单体的形式发挥功能。在极低CO2浓度下，LCIB与LCIA协同完成HCO3-的吸收[15]。但是LCIB参与的Ci吸收的分子机制没有太多证据支持。

LCIB还与其同源物LCIC形成异源多聚体LCIB/LCIC复合物[15]，但LCIC在Ci吸收中是否起作用仍不清楚。LCIB/LCIC复合物一般定位于2个分开的区域，分散在整个基质中或集中分布在蛋白核周围。在極低CO2浓度时，复合物会特异地定位于蛋白核周围，在低CO2浓度或高CO2浓度时，复合物会分布在整个基质中[15]。调控LCIB/LCIC复合物定位的分子机制还不清楚。

在衣藻叶绿体基质中还有一种碳酸酐酶CAH6，其功能是在碱性基质条件下将CO2转化成HCO3-，以维持基质中高浓度的Ci或者重新捕获渗漏的CO2[29]。

除了LCIB/LCIC和CAH6以外，还发现了另外2种LCIB同源物——LCID和LCIE，推测它们可能在Ci吸收中起作用[30]。

2.6 类囊体和蛋白核

在大多数藻类中，Rubisco定位于叶绿体内一个称为蛋白核的结构中（图3）。在衣藻中，蛋白核是一个液体样的细胞器，Rubisco的小亚基（SSU）和EPY1蛋白对蛋白核的形成起重要作用，利于其形成液体样的结构[31]。蛋白核外面被淀粉鞘包围，淀粉鞘的形态直接影响蛋白核的数量和CCM的功能[32]。蛋白核由Rubisco的大小亚基组成[33]，在蛋白核内部，HCO3-被碳酸酐酶CAH3催化脱水生成CO2，被附近的Rubisco羧化进入卡尔文循环。碳酸酐酶CAH3催化HCO3-脱水转化成CO2的效率很高，会促进细胞内Ci的大量积累，可达到野生型的5倍[34]。Blanco-Rivero 等[35]将衣藻从高CO2浓度转移到低CO2浓度时，发现CAH3被磷酸化，碳酸酐酶的活性提高，但CAH3蛋白的量并没有增多，这说明CAH3翻译后加工也可以调控CCM，使其适应低CO2浓度条件。

利用原位低温电子断层扫描术已观察到衣藻蛋白核的三维结构[36]，显示类囊体的垛叠层和蛋白核通过圆柱形的蛋白核小管连接在一起。在蛋白核小管中有成束的多个平行的小管。蛋白核小管上的CAH3催化平行小管中的HCO3-转化成CO2，释放到蛋白核中。

Rubisco主要分布在叶绿体基质和蛋白核中，其动态分布与CO2浓度有关：在受限制的低浓度CO2条件下，几乎所有的Rubisco都分布在蛋白核中，而在高浓度CO2条件下，只有50%的Rubisco定位在蛋白核[33]。Rubisco的大小亚基对蛋白核的形成起重要作用[33]，尤其是小亚基含有重要的结构元件，负责将Rubisco定位于蛋白核中。另外，蛋白CIA6和SAGA1也参与蛋白核的形成[37-38]。SAGA1可调节蛋白核周围淀粉鞘的形态，但CIA6是否直接参与Rubisco的定位和诱导CCM基因表达仍不确定。

2.7 渗漏CO2的重新捕获

蛋白核周围的CO2如果没有及时被Rubisco羧化，则会扩散渗漏。而CO2屏障和CO2循环机制则可防止多余CO2的渗漏。 有研究表明，低CO2浓度下，蛋白CAH6和LCIB/LCIC复合物参与了渗漏CO2的重新捕获过程[29，35];在极低CO2浓度下，蛋白CAH6、LCID或LCIE可重新固定渗漏的CO2。

3 衣藻中CCM的调控

3.1 低浓度CO2环境下CCM的调控

3.1.1 CCM相关基因的调控 。

CCM相关基因在低浓度CO2条件下会出现动态的变化趋势。转录水平上分析发现，许多CCM关键基因在受限制CO2浓度下表达会上调，如LCI1、LCIA、LCIB、HLA3及参与光呼吸的基因[14，17]。蛋白水平上分析发现，低CO2浓度条件下，许多蛋白如碳酸酐酶CAH1、CAH4和CAH5以及2个Ci转运体CCP1和CCP2也会诱导表达[14]。

Brueggeman等[39]

对衣藻转录组数据进行了分析，并统计了低CO2浓度下基因调控的情况;当把衣藻从高CO2浓度转移至受限制的CO2浓度时，15 500个衣藻基因中14%～38%（2 200～5 880个）的基因表达发生改变;在低CO2浓度或者极低CO2浓度下，1 000～2 000个基因表达明显上调，其中许多是CCM相关的基因[39]。另外，一些响应CO2胁迫基因的表达水平发生了剧烈的变化，也包括很多重要的CCM基因，如Ci转运基因（LCI1、LCIA、HLA3、CCP1/2、LCIB等）和CA基因（CAH1、CAH4/5）[40]，其中有些是编码可溶性蛋白和膜蛋白的功能未知的基因，这些基因可用来作为候选基因研究是否参与Ci转运、吸收或其他CCM的功能。另外，有些基因在低CO2浓度下高表达、高CO2浓度下不表达，如LCI1、LCIA、LCR1、HLA3、CCP1、CAH4/5等;也有些CCM关键基因如LCIB和CAH3在低CO2浓度下则表达水平显著上调，而在高CO2浓度下表现为低水平的组成型表达，说明这些基因可能参与了低CO2浓度下CCM的过程。

3.1.2 调控CCM基因表达的元件。大量证据证明，在衣藻中存在一个从多层面调控CCM表达的网络系统，但是对CCM调控的分子机制仍不清楚。目前只有2种调控蛋白CIA5（也称CCM1）和LCR被确认可能调控衣藻中CCM相关基因的表达。

3.1.3 CCM基因的翻译后调控。

基因的翻译后调控在调节细胞功能中广泛存在，这种机制比转录水平的调控更能使细胞快速地应对环境的变化。很早就有研究表明衣藻为了适应受限制CO2浓度会发生蛋白磷酸化，但是CCM相关蛋白的磷酸化是最近才鉴定出来的，如将衣藻从高浓度CO2转移到受限制CO2浓度时，2个类囊体蛋白LCI5和UEP发生了磷酸化[41]， 以及CAH3在受限制CO2浓度时也发生了磷酸化。对衣藻的磷酸化蛋白组进行系统分析也发现了许多CCM相关蛋白的磷酸化，如HLA3、LCIC、LCID、LCI15、CAs以及低CO2浓度下诱导表达的其他蛋白[42]。

除了磷酸化，蛋白质的谷胱甘肽化也是一种翻译后调控，如在衣藻中的LCIB和许多参与卡尔文循环的蛋白[43]。另外，CIA5中存在的SUMO的修饰位点可能也是一种翻译后调控机制，尽管功能未知。

在衣藻適应受限制CO2浓度时可能存在多种翻译后修饰作为信号，但这些修饰的分子机制仍不确定。

3.2 低CO2浓度条件下碳同化的调控

衣藻光合作用的光反应和暗反应过程与高等植物非常相似[20]，然而衣藻因为具有其独特而灵活的碳代谢特征以及细胞内独特的区室化，使其能够在不同的环境中生存和繁殖[3]。在衣藻中，前期固定的Ci最终都要进入卡尔文循环：CO2首先与五碳化合物RuBP在Rubisco的催化下生成两分子的3-磷酸甘油酸（3-PGA），然后通过两步反应将3-PGA还原成3-磷酸甘油醛，此步反应将会消耗光反应中产生的ATP和NADPH，而后3-磷酸甘油醛经过一系列反应重新生成RuBP，其中产生的许多中间产物可参与细胞内其他代谢途径。Rubisco除了催化RuBP与CO2的羧化反应，还会催化RuBP与O2的加氧反应，此反应产生一分子的3-PGA和一分子的磷酸乙醇酸，进入光呼吸代谢途径。当外界环境条件中CO2浓度受限制时，则会有一些代谢的碳从卡尔文循环中流入光呼吸代谢途径。然而，在低CO2浓度条件下，衣藻的卡尔文循环和光呼吸这2种代谢途径都会被调控以适应底物浓度受限的条件。

3.2.1 卡尔文循环。

在衣藻中已经鉴定出卡尔文循环的全部基因，这些基因在高CO2浓度和受限制的低CO2浓度的条件下均发挥作用。研究表明，大多数卡尔文循环中的酶受底物浓度限制，有些酶的浓度比其底物还高[44]。在细胞内只有几种酶的浓度是与底物浓度相似接近饱和的，如Rubisco、FBP（1，6-二磷酸果糖酶）、SBP（1，7-二磷酸景天庚酮糖酶），通过调节这些酶的活性来提高光合效率是一种翻译后调控过程。

为适应低CO2浓度条件，衣藻卡尔文循环中的基因表达会发生变化，如Rubisco亚基RbcS1、RbcS2和RbcL的转录表达会升高;Rubisco小亚基RBCS1、ALD3（醛缩酶）、PGK（磷酸甘油酸激酶）、GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和SBP的转录水平则会下调。有研究表明，卡尔文循环中酶的蛋白数量的变化并非与转录本数量的变化一致[44]。卡尔文循环的调控可能是翻译后修饰或者底物抑制/激活等方面。许多卡尔文循环酶通过翻译后修饰如谷胱甘肽化或铁氧还蛋白二硫键的变化进行氧化还原调控[43，45]。氧化还原调控是建立起来的一种很好的系统，可将光合作用中的光反应和暗反应融合在一起，使细胞在适应多变环境时通过不同的细胞过程进行能量的分配。

3.2.2 光呼吸。

当周围环境中CO2/O2比率降低时，Rubisco加氧酶的活性增强，产生磷酸乙醇酸，进入光呼吸代谢途径，抑制磷酸丙糖异构酶的活性，从而干扰RuBP的再生。转录组水平和代谢水平的研究表明将衣藻从高浓度CO2转移到低浓度CO2后，衣藻会有一个快速且短暂的光呼吸代谢的升高过程。转录组数据显示，当将衣藻细胞从高浓度CO2转入低浓度CO2 4 h后，编码丙氨酸转氨酶（ALT）的基因、甘油酸激酶（GLYK）的基因、乙醇酸脱氢酶（GYD1）的基因、羟基丙酮酸还原酶1（HPR1）的基因、丝氨酸乙醛酸氨基转移酶1（SGA1）的基因和所有编码甘氨酸脱羧酶亚基的基因（二氢硫辛酸脱氢酶1DLDH1除外）均出现基因表达的上调[40]，这些基因的表达受CO2浓度和CIA5的调控。代谢组学的研究表明，光呼吸途径中的中间产物如甘氨酸、甘油酸盐、乙醛酸丝氨酸和3-磷酸甘油醛的量会明显升高。代谢物的水平在衣藻转入低浓度CO2 30 min后升高，但24 h内恢复至初始水平。一般认为衣藻在适应低CO2浓度时，光呼吸途径中酶基因的表达、酶活性和代谢物水平的升高是暂时的，而后随着CCM被诱导，均会恢复至初始的水平，CCM提高了Rubisco周围的CO2浓度从而抑制了Rubisco加氧酶的活性，降低光呼吸。

盡管认为光呼吸是衣藻对外界低CO2浓度时调节碳代谢的重要机制，但许多其他的碳代谢途径如淀粉代谢、糖酵解或脂代谢、呼吸作用中碳代谢均与光合作用过程中碳代谢密切相连，这些代谢与其他营养成分的代谢如氮、硫、磷和金属元素的吸收使得藻类能快速适应多变的环境进行生长繁殖，阐明这个复杂的网络体系将是未来研究的方向。

4 衣藻CCM转入高等植物的研究

为了满足不断增长的全球人口的物质需求，到2050年粮食产量要提高85%以上。仅通过传统农作物选育的方法或者农田扩展的方法，这个目标产量是不可能实现的。已经证实的一个可行的方法是通过遗传工程提高作物的光合效率。光合作用中限制CO2固定的重要因素是Rubisco酶的催化效率低。为了减少光呼吸，一些光合产物会通过CCMs提高Rubisco活性位点周围CO2/O2比率。有模型表明，如果将CCM成功引入主要粮食作物如水稻、小麦和大豆，可以使碳固定提高60%，同时还能提高水和氮的利用率[46]。许多CCM和光合作用工程的策略正在继续研究，最有前景的是将衣藻的CCM转入农作物中以提高农作物的光合效率。为了提高Rubisco周围的CO2浓度，目前正在进行衣藻CCM蛋白核和HCO3-转运体的改造、蓝细菌CCM羧酶体和无机碳转运体的改造、Rubisco蛋白动力学的改造、光呼吸中基因的改造以及优化卡尔文循环中RuBP的再生等[47]。

为了将衣藻的CCM引入高等植物，需要系统完整的分析方法。前期的工作已经取得了重大的进展，如已将蓝细菌的Rubisco转化入烟草质体中以改造C3植物[48];蓝细菌中的HCO3-转运蛋白BicA也成功地在烟草的质体中表达[49];衣藻CCM蛋白HLA3、LCIA和LCIB成功在高等植物中表达，衣藻的Rubisco成功引入拟南芥中并能在拟南芥中稳定表达[50];在大肠杆菌中功能性组装完成了卡尔文循环[51]等。如果要鉴定高等植物中CCM的核心成分，可以将CCM引入到一个异源的、生长迅速、无CCM的光合系统中，如苔藓（小立碗藓）、地钱、植物细胞培养系统或者不含CCM的绿藻中。人工建造一套有功能的CCM的核心成分对于指导植物基因工程有重要作用。

未来研究CCM功能可以通过杂交系统实现，CCM成分可取自多种来源的物种，如绿藻、蓝藻、硅藻、定鞭藻类和角苔。另外，还可通过合成蛋白质执行特定功能，如合成Rubisco连接体用于匹配连接高等植物的Rubisco，合成一种嵌合蛋白用于多种成分的正确组装[52]。

5 总结与展望

衣藻CCM可以增加Rubisco周围的CO2浓度，从而增强光合效率。衣藻CCM中除了典型的Ci吸收系统中转运蛋白HLA3、LCIA和CAs外，衣藻内还发现了许多新的Ci吸收系统，包括LCIB/LCIC、LCI1和未被描述的蛋白，这些蛋白均是受限CO2浓度下诱导表达的。对这些蛋白的分子功能及其他Ci吸收系统进行研究，不仅可以更好地理解CCM，还可以提供一套完整的方案提高藻类和高等植物获取Ci的效率。目前实验室正在研究喀斯特水体中绿藻的CCM与非喀斯特水体中绿藻的CCM的不同，以期能为更深入地理解CCM补充数据支持。

因为真核藻类和高等维管植物进化上有比较近的亲缘关系、相似的光合作用，所以真核藻类的CCM可能有更大的优势转入高等植物。未来迫切需要一个模型用来指导将衣藻的成分转化到高等植物中。将衣藻CCM或者杂交CCM引入C3植物将是一个巨大的挑战，但是正确利用资源一定能将其变成现实。

因为水生环境的复杂多变，以衣藻为模式生物对CCM的许多研究还不是很系统。从细胞水平和分子水平上对蓝细菌和真核微藻CCM机制更详尽的研究以及准确将CCM引入高等植物以提高高等植物的光合作用效率将是未来的研究方向。

参考文献

[1]BENSON A A，CALVIN M.Carbon dioxide fixation by green plants[J].Annu Rev Plant Physiol，1950，1（1）：25-42.

[2] HARRIS E H.Chlamydomonas as a model organism[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52：363-406.

[3] GROSSMAN A R，CROFT M，GLADYSHEV V N，et al.Novel metabolism in Chlamydomonas through the lens of genomics[J].Curr Opin Plant Biol，2007，10（2）：190-198.

[4] MERCHANT S S，PROCHNIK S E，VALLON O，et al.The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions[J].Science，2007，318（5848）：245-250.

[5] SPALDING  M H.Photosynthesis and photorespiration in freshwater green algae[J].Aquat Bot，1989，34（1/2/3）：181-209.

[6] GROSSMAN A R，CATALANOTTI C，YANG W，et al.Multiple facets of anoxic metabolism and hydrogen production in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii[J].New Phytol，2011，190（2）：279-288.

[7] SPALDING M H.Microalgal carbon-dioxide-concentrating mechanisms：Chlamydomonas inorganic carbon transporters[J].J Exp Bot，2008，59（7）：1463-1473.

[8] SPREITZER R J，SALVUCCI M E.RUBISCO：Structure，regulatory interactions，and possibilities for a better enzyme[J].Annu Rev Plant Biol，2002，53：449-475.

[9] GIORDANO M，BEARDALL J，RAVEN  J A.CO2 concentrating mechanisms in algae：mechanisms，environmental modulation，and evolution[J].Annu Rev Plant Biol，2005，56：99-131.

[10] SAGE R F，SAGE T L，KOCACINAR F.Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis[J].Annu Rev Plant Biol，2012，63：19-47.

[11] PRICE G D，PENGELLY J J L，FORSTER B，et al.The cyanobacterial CCM as a source of genes for improving photosynthetic CO2 fixation in crop species[J].J Exp Bot，2013，64（3）：753-768.

[12] MCGRATH J M，LONG S P.Can the cyanobacterial carbon-concentrating mechanism increase photosynthesis in crop species？ A theoretical analysis[J].Plant Physiol，2014，164（4）：2247-2261.

[13] PRICE G D，BADGER M R，WOODGER F J，et al.Advances in understanding the cyanobacterial CO2-concentrating-mechanism （CCM）：Functional components，Ci transporters，diversity，genetic regulation and prospects for engineering into plants[J].J Exp Bot，2008，59（7）：1441-1461.

[14] WANG Y J，STESSMAN D J，SPALDING M H.The CO2 concentrating mechanism and photosynthetic carbon assimilation in limiting CO2：How Chlamydomonas works against the gradient[J].The plant journal，2015，82（3）：429-448.

[15] WANG Y J，SPALDING M H.Acclimation to very low CO2：Contribution of limiting CO2 inducible proteins，LCIB and LCIA，to inorganic carbon uptake in Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Physiol，2014，166（4）：2040-2050.

[16] COLEMAN J R，LUINENBURG I，MAJEAU N，et al.Sequence analysis and regulation of expression of a gene coding for carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii[J].Can J Bot，1991，69（5）：1097-1102.

[17] BUROW  M D，CHEN  Z Y，MOUTON T M，et al.Isolation of cDNA clones of genes induced upon transfer of Chlamydomonas reinhardtii cells to low CO2[J].Plant Mol Biol，1996，31（2）：443-448.

[18] OHNISHI N，MUKHERJEE B，TSUJIKAWA T，et al.Expression of a low CO2-inducible protein，LCI1，increases inorganic carbon uptake in the green alga Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Cell，2010，22（9）：3105-3117.

[19] MORONEY J V，MA Y B，FREY W D，et al.The carbonic anhydrase isoforms of Chlamydomonas reinhardtii：Intracellular location，expression，and physiological roles[J].Photosynth Res，2011，109（1/2/3）：133-149.

[20] SPALDING M H.The CO2-concentrating mechanism and carbon assimilation[M]//HARRIS E H，STERN D B，WITMAN G B.

The chlamydomonas sourcebook：Vol 2.2nd ed.London：Academic Press，2009：257-301.

[21] AMOROSO G，SLTEMEYER D，THYSSEN C，et al.Uptake of HCO3- and CO2 in cells and chloroplasts from the microalgae Chlamydomonas reinhardtii and Dunaliella tertiolecta[J].Plant Physiol，1998，116（1）：193-201.

[22] WU W，PETERS J，BERKOWITZ G A.Surface charge-mediated effects of Mg2+ on K+ flux across the chloroplast envelope are associated with regulation of stromal pH and photosynthesis[J].Plant Physiol，1991，97（2）：580-587.

[23] CHEN Z Y，LAVIGNE L L，MASON C B，et al.Cloning and overexpression of two cDNAs encoding the low-CO2-inducible chloroplast envelope protein LIP-36 from Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Physiol，1997，114（1）：265-273.

[24] POLLOCK S V，COLOMBO S L，PROUT D L，et al.Rubisco activase is required for optimal photosynthesis in the green alga Chlamydomonas reinhardtii in a low-CO2 atmosphere[J].Plant Physiol，2003，133（4）：1854-1861.

[25] ROLLAND N，DORNE A J，AMOROSO G，et al.Disruption of the plastid ycf10 open reading frame affects uptake of inorganic carbon in the chloroplast of Chlamydomonas[J].EMBO J，1997，16（22）：6713-6726.

[26] KATOH A，LEE K S，FUKUZAWA H，et al.cemA homologue essential to CO2 transport in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（9）：4006-4010.

[27] PRICE G D，MAEDA S I，OMATA T，et al.Modes of active inorganic carbon uptake in the cyanobacterium，Synechococcus sp.PCC7942[J].Funct Plant Biol，2002，29（3）：131-149.

[28] YAMANO T，TSUJIKAWA T，HATANO K，et al.Light and low-CO2-dependent LCIB-LCIC complex localization in the chloroplast supports the carbon-concentrating mechanism in Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Cell Physiol，2010，51（9）：1453-1468.

[29] MORONEY J V，YNALVEZ R A.Proposed carbon dioxide concentrating mechanism in Chlamydomonas reinhardtii[J].Eukaryot Cell，2007，6（8）：1251-1259.

[30] WANG  Y J，SPALDING M H.An inorganic carbon transport system responsible for acclimation specific to air levels of CO2 in Chlamydomonas reinhardtii[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（26）：10110-10115.

[31] FREEMAN ROSENZWEIG E S，XU B，CUELLAR L K，et al.The eukaryotic CO2-concentrating organelle is liquid-like and exhibits dynamic reorganization[J].Cell，2017，171（1）：148-162.

[32] MUKHERJEE A，MORONEY J V.How protein-protein interactions contribute to pyrenoid formation in Chlamydomonas[J].J Exp Bot，2019，70（19）：5033-5035.

[33] MEYER M T，GENKOV T，SKEPPER J N，et al.Rubisco small-subunit a-helices control pyrenoid formation in Chlamydomonas[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（47）：19474-19479.

[34] SHUTOVA T，KENNEWEG H，BUCHTA J，et al.The photosystem II-associated Cah3 in Chlamydomonas enhance the O2 evolution rate by proton removal[J].EMBO J，2008，27（5）：782-791.

[35] BLANCO-RIVERO A，SHUTOVA T，ROMN  M J，et al.Phosphorylation controls the localization and activation of the lumenal carbonic anhydrase in Chlamydomonas reinhardtii[J].PLoS One，2012，7（11）：1-10.

[36] ENGEL B D，SCHAFFER M，CUELLAR L K，et al.Correction：Native architecture of the Chlamydomonas chloroplast revealed by in situ cryo-electron tomography[J/OL].eLife，2015，4[2020-03-25].https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26367339/.doi：10.7554/eLife.11383.

[37] MA Y B，POLLOCK S V，XIAO Y，et al.Identification of a novel gene，CIA6，required for normal pyrenoid formation in Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Physiol，2011，156（2）：884-896.

[38] ITAKURA A K，CHAN K X，ATKINSON N，et al.A Rubisco-binding protein is required for normal pyrenoid number and starch sheath morphology in Chlamydomonas reinhardtii[J].Proc Natl Acad Sci USA，2019，116（37）：18445-18454.

[39] BRUEGGEMAN A J，GANGADHARAIAH D S，CSERHATI M F，et al.Activation of the carbon concentrating mechanism by CO2 deprivation coincides with massive transcriptional restructuring in Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Cell，2012，24（5）：1860-1875.

[40] FANG W，SI Y Q，DOUGLASS S，et al.Transcriptome-wide changes in Chlamydomonas reinhardtii gene expression regulated by carbon dioxide and the CO2-concentrating mechanism regulator CIA5/CCM1[J].Plant Cell，2012，24（5）：1876-1893.

[41] TURKINA M V，BLANCO-RIVERO A，VAINONEN J P，et al.CO2 limitation induces specific redox-dependent protein phosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii[J].Proteomics，2006，6（9）：2693-2704.

[42] WANG H X，GAU B，SLADE W O，et al.The global phosphoproteome of Chlamydomonas reinhardtii reveals complex organellar phosphorylation in the flagella and thylakoid membrane[J].Mol Cell Proteomics，2014，13（9）：2337-2353.

[43] ZAFFAGNINI M，BEDHOMME M，GRONI H，et al.Glutathionylation in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii：A proteomic survey[J].Mol Cell Proteomics，2012，11（2）：1-15.

[44] METTLER T，MHLHAUS T，HEMME D，et al.Systems analysis of the response of photosynthesis，metabolism，and growth to an increase in irradiance in the photosynthetic model organism Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Cell，2014，26（6）：2310-2350.

[45] MORISSE S，MICHELET L，BEDHOMME M，et al Thioredoxin-dependent redox regulation of chloroplastic phosphoglycerate kinase from Chlamydomonas reinhardtii[J].J Biol Chem，2014，289（43）：30012-30024.

[46] LONG S P，MARSHALL-COLON A，ZHU X G.Meeting the global food demand of the future by engineering crop photosynthesis and yield potential[J].Cell，2015，161（1）：56-66.

[47] MACKINDER L C M，CHEN C，LEIB R D，et al.A spatial interactome reveals the protein organization of the algal CO2-concentrating mechanism[J].Cell，2017，171（1）：133-147.

[48] LIN M T，OCCHIALINI A，ANDRALOJC P J，et al.A faster Rubisco with potential to increase photosynthesis in crops[J].Nature，2014，513（7519）：547-550.

[49] PENGELLY J J，FRSTER B，VON CAEMMERER S，et al.Transplastomic integration of a cyanobacterial bicarbonate transporter into tobacco chloroplasts[J].J Exp Bot，2014，65（12）：3071-3080.

[50] ATKINSON N，LEITN，ORR D J，et al.Rubisco small subunits from the unicellular green alga Chlamydomonas complement Rubisco-deficient mutants of Arabidopsis[J].New Phytol，2017，214（2）：655-667.

[51] ANTONOVSKY N，GLEIZER S，NOOR E，et al.Sugar synthesis from CO2 in Escherichia coli[J].Cell，2016，166（1）：115-125.

[52] GONZALEZ-ESQUER C R，SHUBITOWSKI T B，KERFELD C A.Streamlined construction of the cyanobacterial CO2-fixing organelle via protein domain fusions for use in plant synthetic biology[J].Plant Cell，2015，27（9）：2637-2644.