铁钉菜水提醇沉上清液部分的抗氧化、抗酪氨酸酶活性及其冲剂的降糖作用

黄晓冬， 黄世英， 蔡建秀， 王玲平， 孙 波， 谢秋燕

（1. 泉州师范学院 海洋与食品学院， 福建 泉州362000；2. 华侨大学 福建省分子医学重点实验室， 福建 厦门361021；3. 福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室，福建 泉州362000）

大型海藻资源丰富，自古以来是沿海居民药食两用的食材。 分布在我国东南沿海中、高潮带岩礁的褐藻铁钉菜（Ishige okamuraiYendo）系北太平洋西部特有的可食海藻，其甲醇提取物具有较高的多酚含量，甲醇提取物的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水等5 个萃取部分均具有一定的抗氧化活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性[1-2]，80%甲醇提取物可通过改变肝葡萄糖代谢酶活性、改善胰岛素抵抗起到降血糖的作用[3]。 考虑提取成本与应用安全性的因素，结合前期铁钉菜甲醇提取物水部位有抗氧化与α-葡萄糖苷酶抑制活性的基础上，作者设计以水提醇沉法提取获得铁钉菜水提醇沉物与水提醇沉上清液部分，在初步比较两者相关活性的前提下，选取水提醇沉上清液部分进行抗氧化、抗酪氨酸酶活性研究，并进行冲剂制备与体内外降糖活性检测，旨为铁钉菜水提醇沉上清液部分的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 铁钉菜水提醇沉上清液部分的制备

新鲜铁钉菜藻体采自福建泉州围头半岛海域中、高潮带岩礁，藻体剔除异物，清洁海水洗除杂质，组织粉碎机粉碎后，按料液比（1 g∶30 mL）加蒸馏水，90～100 ℃水浴提取两次，每次2 h，抽滤后取滤液减压浓缩（-0.09 MPa，65 ℃）至一定体积，加入无水乙醇使体系中乙醇体积分数为75%，4 ℃醇沉24 h 后，4 000 r/min 离心5 min 得上清液与醇沉物。上清液减压浓缩（-0.09 MPa，65 ℃），冻干后制得铁钉菜水提醇沉上清液部分 （supernatants from water extracting-alcohol precipitation of Ishige okamurai，以下简称SWEAPI）。

1.2 SWEAPI 的抗氧化活性测定

参照刘冬冬等[4]的方法测定DPPH 自由基清除活性，以维生素C 作为阳性对照；参照黄晓冬等[5]的方法测定羟基自由基清除活性，以2，6-二叔丁基对甲酚BHT 为阳性对照。以样液浓度对清除率拟合回归方程，求得半数效应质量浓度EC50。

1.3 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性测定

参照石嘉怿[6]的方法略加修改。 具体步骤为：取1.0 mL 样 液，0.4 mL 100 U/mL 酪 氨 酸 酶 溶 液（50 mmol/L pH 6.8 磷 酸 盐 缓 冲 液PBS 配 制），2.8 mL 0.5 mmol/L 多巴（L-DOPA）底物溶液，充分混匀后37 ℃水浴保温10 min， 测波长475 nm 处的吸光度值，实验重复3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：As为样液组的吸光度值；A0为空白对照组（以PBS 代替样液） 的吸光度值；A1为空白对照组背景吸光度值（以PBS 代替样液与酪氨酸酶溶液）；Ab为样液背景吸光度值（以PBS 代替酪氨酸酶溶液）。

以样液质量浓度对抑制率拟合回归方程，求得半数抑制质量浓度IC50。

1.4 铁钉菜冲剂的制备工艺条件优选与质量评价

1.4.1 制备工艺SWEAPI 与一定比例的可溶性淀粉、 甜蜜素、β-环状糊精混合后， 稍加适量95%乙醇，制成捏可成团、压可散开的软材，过40 目药筛制粒，制粒后80 ℃干燥、整粒、紫外灭菌、密封包装。

1.4.2 正交试验设计以SWEAPI 与可溶性淀粉、甜蜜素、β-环状糊精的比例用量为因子， 设置三个水平进行按L9（34）正交设计与实验，因子水平见表1。 实验结果参考全山丛等[7]的评分方法进行综合评价，根据制粒难易程度、溶化性、溶化后固形物残留量、味觉、感官性状等分别等级评分，各项评分按权重折算求总分， 以此作为正交优选的考察指标，各项评分指标与等级标准见表2。

表1 制粒工艺试验因子水平表Table 1 Granulating process test factors and levels of orthogonal experiment

表2 评分标准与权重Table 2 Grading standard and proportion

1.4.3 铁钉菜冲剂产品质量的评价称取0.25 g样品置于盛有250 mL 生理盐水的无菌均质杯中，8 000~10 000 r/min 均质2 min， 制成1∶1 000 的样品匀液，按GB 4789.2-2010 的方法[8]进行卫生学检查， 微生物限量按保健 （功能） 食品通用标准GB 16740-1997[9]进行描述；直接干燥法测定水分质量分数[10]；苯酚-硫酸法测定总糖质量分数[11]，结果以葡萄糖计；凯式定氮法[12]测定冲剂蛋白质质量分数（考马斯亮蓝法[13]测上清液部分蛋白质质量分数）；福林酚法测定多酚质量分数，结果以没食子酸计[14]。

1.5 铁钉菜冲剂对α-葡萄糖苷酶活性抑制的测定

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定参照Li T 等[15]的方法。在96 孔酶标板上依次加入112 μL 0.1 mol/L PBS （pH 6.8），20 μL 0.2 U/mL α-glucosidase，8 μL样液 （以二甲亚砜DMSO 配制），37 ℃恒温15 min后加入2.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷PNPG 20 μL，经反应15 min 后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液终止反应，酶标仪405 nm 波长下测吸光度值，重复实验3 次，取平均值。

酶活性抑制率的公式：

式中：A1为样液组的吸光度值；A2为以PBS 代替酶溶液测得的样液组背景吸光度值；A3为以DMSO 代替样液测得的空白对照组吸光度值；A4为以DMSO代替样液与PBS 代替酶溶液测得的空白对照组背景吸光度值。

1.6 铁钉菜冲剂对四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的的降糖作用

雄性、体质量（22±1） g 的SPF 级健康KM 小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供， 许可证号为SCXK（沪）2012-0002）于鼠房适应性喂养3 d，食量适当，饮水充足，保持鼠房温度18～20 ℃。 3 d后禁食不禁水12 h，按200 mg/kg 剂量腹腔注射2%四氧嘧啶溶液（无菌生理盐水配制）， 随机选取10只小鼠作为正常组（NC）腹腔注射等体积的生理盐水。1 h 后恢复正常饮食，3 d 后断尾取血（取血前小鼠禁食不禁水12 h）， 血糖仪 （三诺安稳YZBI 湘004-2012， 长沙三诺生物传感技术股份有限公司）测血糖值，隔天再测一次血糖，以血糖值稳定并且大于11.1 mmol/L 且出现多饮、多食、多尿现象的小鼠视为造模成功。

将建模成功的糖尿病小鼠按体质量、血糖值分为5 组，各组动物血糖平均差值不大于0.5 mmol/L，每组10 只，分别记为糖尿病模型对照组（MC）、阳性对照盐酸二甲双胍组（MH，500 mg/kg）、铁钉菜冲剂低剂量组 （LI，350 mg/kg）、 铁钉菜冲剂中剂量组（MI，700 mg/kg）、 铁钉菜冲剂高剂量组（HI，1400 mg/kg）。给药组每天下午5 时按剂量灌胃给药一次，正常组和模型组每天给予等量的生理盐水， 连续14 d。每7 天测一次空腹血糖 （晚餐后禁食不禁水12 h，次日早晨7～8 时测定血糖值）。 实验末，参考陈玲玲等[16]的方法测定糖耐量，即测空腹血糖值后按剂量灌胃1 次，20 min 后灌胃葡萄糖2.0 g/kg，测定给葡萄糖后0.5、1、2 h 的血糖值。

2 结果与分析

2.1 SWEAPI 的抗氧化活性

2.1.1 SWEAPI 对DPPH 自由基的清除作用不同质量浓度的SWEAPI 样液对DPPH 自由基的清除作用见图1。 在质量浓度0～2.0 mg/mL 范围内，SWEAPI 对DPPH 自由基清除的量效关系均随样液质量浓度的增大而增强，2.0 mg/mL 时DPPH 自由基清除率可达（73.66±1.53）%，剂量-效应呈现极显著的正相关 （P＜0.01）， 满足线性回归方程y=36.218x+7.230（R2=0.952 6，P＜0.01）。 由此方程可计算出SWEAPI 清除DPPH 自由基的半效应质量浓度为EC501.18 mg/mL，与本实验测得的0.054 mg/mL VC具有等效作用。

图1 铁钉菜水提醇沉上清液部分对DPPH 自由基的清除作用Fig. 1 DPPH radical scavenging effect of SWEAPI

2.1.2 SWEAPI 对羟基自由基的清除作用在质量浓度0～8.0 mg/mL 范围内，SWEAPI 对羟基自由基的清除能力随样液质量浓度的增大而增强，见图2。量效关系满足logistic 方程，经拟合并计算出其EC50为5.08 mg/mL，与3.04 mg/mL 的人工合成抗氧化剂2，6-二叔丁基对甲酚BHT 等效。

图2 铁钉菜水提醇沉上清液部分对羟基自由基的清除作用Fig. 2 Hydroxy radical scavenging effect of SWEAPI

2.2 SWEAPI 的抗酪氨酸酶活性

SWEAPI 对酪氨酸酶活性的影响见图3。 图3显示，SWEAPI 具有较强的酪氨酸酶活性抑制作用，在质量浓度为0.25～6.0 mg/mL 范围内，酶活抑制率为（24.51±2.04）%～（88.37±5.43）%，酶活抑制率随样液质量浓度的增大而增强， 呈现极显著正相关的量效关系（P＜0.01），经非线性方程拟合并计算出其对酪氨酸酶活性的半抑制质量浓度IC50为1.27 mg/mL。

2.3 铁钉菜冲剂的制备工艺与产品质量评价

2.3.1 铁钉菜冲剂的制备工艺优化以SWEAPI与可溶性淀粉、 甜蜜素、β-环状糊精的比例用量为因子，设置三个水平进行按L9（34）正交设计与实验，实验结果与综合评分见表3，方差分析见表4。

图3 铁钉菜水提醇沉上清液部分对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig. 3 Tyrosinase inhibiting effect of SWEAPI

表3 铁钉菜冲剂制粒工艺正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal experiment design and results of granulation process of Ishige okamurai granules

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

由表3～4 可以看出， 可溶性淀粉， 甜蜜素与SWEAPI 比例以及β-环状糊精的使用量对冲剂制备均有显著影响，影响大小依次为A＞B＞C，优化的工艺条件为A1B1C2，即SWEAPI 与可溶性淀粉比例为1∶2，SWEAPI 与甜蜜素比例为30∶1，β-环状糊精∶SWEAPI 比例为25∶100， 也就是SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-环状糊精为30∶60∶1∶7.5 的质量配比。按此工艺条件铁钉菜冲剂制粒容易、 溶化性较好、腥味少、甜味适中，具海藻类特有的气味。

2.3.2 铁钉菜冲剂的产品质量指标实验测得铁钉菜冲剂的含水量约为6.3 %，水分要求符合GB/T 29602-2013[17]固体饮料不高于7 %的规定；细菌总数≤1 000 cfu/mL，符合保健（功能）食品通用标准GB 16740-1997 规定的卫生要求； 总糖质量分数约为18.74%； 凯式定氮法测得蛋白质质量分数16.60%（考马斯亮蓝法测得SWEAPI 蛋白质质量分数为21.68%）；多酚质量分数2.53%（SWEAPI 多酚质量分数为8.30%）。

2.4 铁钉菜冲剂的α-葡萄糖苷酶抑制活性

铁钉菜冲剂对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果见图4。 由图4 可知，铁钉菜冲剂对α-葡萄糖苷酶活性表现为较强的抑制作用，样液质量浓度0.50 mg/mL时，酶活抑制率可达87.95 %，在0.17～0.50 mg/mL的测量质量浓度范围内，量效满足线性回归方程y= 269.04x－50.185（R2-0.977，P＜0.01），呈现极显著的正相关（P＜0.01），半抑制质量浓度IC50为0.37 mg/mL。

图4 铁钉菜冲剂对α-葡萄糖苷酶活性的抑制Fig. 4 Inhibitory activity of Ishige okamurai granules against α-glucosidase

2.5 铁钉菜冲剂对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的的降糖作用

以四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型研究铁钉菜冲剂的降糖作用，实验结果见表5。 由表5 可知，与模型组比较， 钉钉菜冲剂各剂量组在观测时程7 d 与14 d 内均有一定的降血糖作用，差异具有极显著的统计学意义（P＜0.01），并且各剂量组降糖作用与盐酸二甲双胍组的降糖作用差异不具有统计学意义（P＞0.05），14 d 时各剂量组间降糖作用差异也不具有统计学意义（P＞0.05），说明铁钉菜冲剂350 mg/kg的使用剂量已能有效发挥降血糖效果。

表5 铁钉菜冲剂对四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型血糖值的影响（n=10）Table 5 Effect of Ishige okamurai granules on blood glucose value in alloxan-induced diabetic mice

一般来讲， 在口服葡萄糖后，0.5～1 h 时血清葡萄糖水平升高达峰值，2 h 后恢复至空腹血糖值。 由表6 可看出，铁钉菜冲剂各剂量组小鼠在口服葡萄糖后的血糖值在每一个时间点均显著低于模型对照组（MC）血糖值（P＜0.01），说明铁钉菜冲剂可以在短时间内降低餐后血糖，并且其降糖效果与阳性药物二甲双胍相近（P＞0.05）。

表6 铁钉菜冲剂对四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型糖耐量的影响（n=10）Table 6 Effect of Ishige okamurai granules on glucose tolerance in alloxan-induced diabetic mice

3 结 语

水提醇沉法（水醇法）系指在样品的水提浓缩液中加入乙醇使达不同含醇量， 使得某些化学成分在醇溶液中溶解度降低而析出沉淀， 固液分离后分别获得水提醇沉物与水提醇沉上清液部分， 该法可避免毒性较大有机溶剂的应用，降低后续处理的成本，是精制水提液的简单方法。 作者采用水醇法制得铁钉菜水提醇沉物（EWEAPI） 与水提醇沉上清液部分（SWEAPI）， 经DPPH 自由基清除反应发现，SWEAPI较之EWEAPI 具有较强的DPPH 自由基清除能力，半效应质量浓度EC50为1.19 mg/mL； 清除羟基自由基的EC50为5.08 mg/mL，表现出较强的抗氧化活性。研究指出，海藻由于生境的特殊性使其具有与陆岸植物差异较大的化学组成，存在着多糖、多酚等各种抗氧化活性成分， 是天然抗氧化剂开发的潜在资源[18]。SWEAPI 的抗氧化活性可能与其较高的多酚含量（8.30%）有关。 多酚的酚羟基结构往往使其具有较强的还原性和自由基捕捉活性，这种活性以及络合酪氨酸酶分子中Cu2+的可能性还可使之具有抑制该酶活力的作用[19]。 我们的前期研究已经证实铁钉菜甲醇提取物具有较高的多酚含量与明显的酪氨酸酶抑制作用[1]，本实验中SWEAPI 亦表现出较强的酪氨酸酶抑制活性，半抑制质量浓度IC50为1.27 mg/mL。酪氨酸酶过量表达与人体雀斑、黄褐斑与老年班等色素沉着性疾病有关，SWEAPI 的抗氧化、 抗酪氨酸酶活性有望使之成为开发海藻源抗氧化型、美白护肤品的良好基料。

海藻在降血糖方面亦有独特的功效，羊栖菜多糖[20]、多管藻总酚[21]、海带多糖[22]、泡叶藻多糖与多酚组分[23]等均表现出降血糖活性。本实验发现SWEAPI具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性， 提示其作为α-葡萄糖苷酶抑制剂开发的可行性。 研究指出α-葡萄糖苷酶抑制剂可延缓或阻碍碳水化合物的消化，延迟葡萄糖的吸收，其作用过程温和持久、毒副作用小，为降餐后血糖的首选药物[2]。 因此，我们选择SWEAPI 与可溶性淀粉、 甜蜜素以及β-环状糊精按比例进行冲剂制备，经正交设计与实验优化出SWEAPI∶可溶性淀粉∶甜蜜素∶β-环状糊精为质量比30∶60∶1∶7.5 的铁钉菜冲剂制备工艺， 按此工艺条件制粒容易、溶化性较好、腥味降低、甜味适中。 该冲剂的体外α-葡萄糖苷酶半抑制质量浓度IC50为0.37 mg/mL，350 mg/kg 灌胃给药14 d 对四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的降糖作用与盐酸二甲双胍组（500 mg/kg）的降糖作用差异不具有统计学意义（P＞0.05），并且能短时间内降低餐后血糖，这说明铁钉菜冲剂在长时间和短时间内均能发挥一定的降血糖效果，其原因是否与α-葡萄糖苷酶抑制、清除自由基、激活胰岛素分泌相关仍需深入的研究。