耐盐菌发酵对咸鸭蛋蛋清脱盐及抗氧化活性的影响

陈远哲， 黄熙莺， 鲁安娜， 尉鑫欣， 王柳雄， 龚金炎， 肖功年*

（1. 浙江科技学院 省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州310023；2. 嘉兴市家家乐食品有限责任公司，浙江 嘉兴314018）

我国属于禽蛋生产大国， 鸭蛋产量居世界首位。 浙江省粽子产业发达，然而每年因生产咸蛋黄粽而遗留下数万吨咸蛋清， 由于其高盐质量分数（7%～12%）以及黏度高，始终无法得到有效地利用。鸭蛋清蛋白是一种优质的蛋白质资源，其氨基酸组成与鸡蛋清相似[1]。

目前对咸鸭蛋清的处理除直接用于高品质面条[2]，重组鱼粒[3-4]外，还将其酶解脱盐，通过酶解产生的小肽类物质大大提高其附加值。 其中最关键的一步便是脱盐，然而常规的脱盐手法如超滤[5]、电渗析等方法，存在堵塞和黏附等问题，同时由于咸蛋清营养价值丰富，易于微生物繁殖，一旦污染导致滤膜难清洗、再生困难等问题。 先酶解[6]，虽然在一定程度上能降低咸鸭蛋蛋清黏度，缓解了膜技术脱盐过程存在的过滤膜易堵塞的问题，但在高浓度的盐环境中，酶活性会降低或受到抑制，酶解效率降低，酶解咸蛋清的酶及酶解参数，更是难以选择和调控[7]。

作者从腌制食品中筛选出耐盐菌株Staphylococcus equorum，接种于咸鸭蛋清中，在最适条件下发酵。 发酵法的优势是将微生物产酶和酶水解相结合，简化生产工艺，降低成本，极大得提高咸鸭蛋蛋清的附加值，为咸鸭蛋蛋清的再生利用提供一条新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金华火腿、咸鸭蛋蛋清：市售；10%含盐质量分数的MSA 培养基、牛血清蛋白、VC（Trolox）、乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、抗坏血酸（分析纯）、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、铁氰化钾（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）、氯化铁（分析纯）、菲啰嗪、氯化亚铁（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、硫代巴比妥酸（分析纯）、软磷脂（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）。

DV-S 型数显粘度计：美国brookfield；UV-5200PC型紫外分光光谱：上海元析仪器有限公司；TG16K-Ⅱ型离心机：上海赵迪生物科有限公司；UDK159 凯式定氮仪：VELP 公司；DK20 消化炉：VELP 公司；真空冷冻干燥机；Millipore 超滤离心管。

1.2 实验方法

1.2.1 不同发酵时间咸鸭蛋蛋清粘度的变化参照叶青松[8]等人的方法，取适量待测样品，置于100 mL 的烧杯中，选用s61 号转子，转速100 r/min，测定黏度值。

1.2.2 咸蛋清发酵产物制备分别取适量鸭蛋清和沉淀物加去离子水振荡30 min， 离心取上清液，0.22 um 膜过滤后， 分别用10 000 和3 000 的超滤膜离心截留分离，保留浓缩液，分别标记为组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（空白组），发酵组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，冻干备用。

1.3 测试方法

1.3.1 盐质量分数及脱盐率测定参照文献[9]的方法。

1.3.2 蛋白质质量分数测定可溶性蛋白质质量分数和粗蛋白质质量分数，分别采用考马斯亮蓝法[10]和凯氏定氮法[11]测定。

1.3.3 DPPH·清除能力测定参照文献[12]的方法。

1.3.4 Fe2+螯合能力的测定参照文献[13]的方法。

1.3.5 抑制脂过氧化能力的测定参照文献[14]的方法。

1.3.6 还原力测定参照文献[15]的方法。

2 结果与讨论

2.1 咸鸭蛋蛋清发酵后理化指标的测定

2.1.1 咸鸭蛋蛋清发酵过程黏度的变化咸鸭蛋去掉蛋黄后蛋清一般比较粘稠，据叶青松等人的报道，咸鸭蛋蛋清不经处理，黏度在80 mPa·s 左右，黏度是表征咸蛋清膜法脱盐效率的重要特征之一[16]，Staphylococcus equorum不同发酵时间对黏度的影响见图1。

图1 咸蛋清不同发酵时间粘度的变化Fig. 1 Change of viscosity of different fermentation

鸭蛋经过腌制，蛋清蛋白逐渐水样化，但仍具有一定的黏度，从图1 中得知，0 h 咸鸭蛋清的黏度在20 mPa·s 左右，无论是对膜脱盐还是膜过滤都会造成膜孔堵塞等严重影响[17]。 接入Staphylococcus equorum菌悬液，发酵初期，在微生物的作用下黏度迅速下降，随着发酵时间的增长，逐渐趋于平缓，但黏度仍不断的降低，最终达到零。

2.1.2 发酵不同时间pH 的变化， 上清液及离心沉淀中的盐质量分数发酵过程中pH 的变化见图2。 本次实验所用的咸鸭蛋蛋清盐质量分数为10%，每隔12 小时取一次样测pH 值，离心后对上清液及沉淀物的盐质量分数进行测定。 由图3 可知，沉淀物中盐质量分数大约在3%左右。 咸蛋清发酵过程中，耐盐菌分泌的蛋白酶破坏蛋白质的结构[18]，蛋清蛋白与水形成的胶状结构被破坏，水分析出带走部分盐分；随着pH 的降低，部分蛋白质及肽类物质，达到其等电点并形成沉淀[19]，此时发酵液已明显分层，通过离心取沉淀物，大部分盐仍留在上清液中，从而达到脱盐的目的。3%左右的盐质量分数与新鲜咸蛋清相比，脱盐率可达70%，且挤出多余的水分后沉淀物中的盐质量分数会进一步降低。 沉淀物冻干粉中的盐质量分数只有15%，也已远远低于咸蛋清冻干粉中38%的盐质量分数，见图4。

图2 发酵不同时间pH 的变化Fig. 2 pH of different fermentation

2.1.3 离心沉淀物冻干粗蛋白质质量分数由图5可知，0 小时代表新鲜咸鸭蛋蛋清，由于该耐盐菌株在生长过程中产酸，沉淀物中蛋白质来源大致有三部分组成，菌体、遇酸沉淀的蛋白质以及部分不可溶的蛋清蛋白。发酵36 h 的沉淀物粗蛋白质质量分数高于冻干咸蛋清粉，盐质量分数大大低于冻干咸蛋清，是一种很好的高蛋白、低含盐质量分数的饲料添加成分。 随着发酵时间的延长，微生物活动消耗，蛋白质质量分数逐渐降低。

图3 发酵不同时间上清液及离心沉淀中的盐质量分数Fig. 3 Salt content of different fermentation of the supernatant and precipitate

图4 发酵不同时间沉淀物冻干粉盐质量分数Fig. 4 Salt content of differentfermentation of the freezedried precipitate

图5 发酵不同时间沉淀物冻干粗蛋白质量分数Fig. 5 Protein content ofdifferent fermentation of the freeze-dried precipitate

2.2 咸蛋清发酵产物抗氧化活性的测定

2.2.1 蛋白质质量浓度测定的标准曲线如图6所示，表明在0~0.1 mg 范围内牛血清蛋白的质量浓度与吸光度呈较好的线性关系， 线性回归方程为Y=6.982 6X+，0.009 17，R2=0.997 0。

图6 牛血清蛋白质标准曲线Fig. 6 Standard curve of bovine serum albumin solution

2.2.2 发酵产物DPPH·清除能力测定二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一种稳定的自由基，在波长517 nm 处有最大吸收峰， 当体系中有强抗氧化剂存在时，孤对电子会被配对，吸光值下降，其褪色程度与结合的电子数有定量关系[20]，见图7。

图7 发酵产物体外DPPH·自由基清除活性Fig. 7 Scavenging activity of different fermentation samples to DPPH·in vitro

比较图7 中空白组和发酵组间发现，发酵组组分Ⅲ的IC50值远低于对照组，表现出较强的抗氧化活性， 有研究发现一些特定氨基酸 （如Glu、 Asp、Lys、Leu 和Ala） 的存在能够增强肽的抗氧化性。Lys 等因其侧链有氨基或羧基， 而具有清除自由基和螯合金属离子的能力[21-22]。 空白组由于蛋清蛋白相对分子质量均在10 000 以上，故超滤离心后得不到组分Ⅱ、Ⅲ，检测不到抗氧化活性。 发酵组组分Ⅰ检测不到活性的原因，猜测是因为具有抗氧化活性的小肽含量比较少，且复杂的环境成分对实验有一定的干扰。 由此可得出耐盐菌发酵后能增强咸蛋清蛋白的抗氧化活性。

2.2.3 发酵产物Fe2+螯合能力的测定比较图8 中空白组和发酵组发现，其还原力与相对分子质量大小有一定关系。相对分子质量越小，还原力越强。发酵组组分Ⅲ的IC50远小于对照组，具有极强的抗氧化活性，较空白组而言，是从无到有的突破；发酵组组分Ⅱ的IC50虽然大于对照组， 但与空白组相比较，仍具有较强的抗氧化活性。 空白组的三个组分均检测不到抗氧化活性，由此可得出，耐盐菌发酵有助于增强咸蛋清蛋白的抗氧化活性。 有研究表明[23-24]，Fe2+螯合能力不仅与样品中杂环化合物的含量也有较大的关联，与样品中的大分子物质也有很大的关联。

图8 发酵产物体外Fe2+螯合能力Fig. 8 Fe2 + chelating ability of different fermentation samples in vitro

2.2.4 发酵产物抗脂质过氧化能力的测定该方法利用多不饱和脂肪酸在氧化过程中，产生的丙二醛和硫代巴比妥酸反应生成红色物质， 该物质在532 nm 处有强吸收峰。抗氧化剂能抑制多不饱和脂肪酸的自动氧化，丙二醛的生成量随之降低，红色变淡甚至消失，因此可以通过测定反应溶液的吸光值来检测产物的抗氧化效果[25]，见图9。

图9 发酵产物体外抑制脂质过氧化能力Fig. 9 Inhibiting lipid peroxidation ability of different fermentation samples in vitro

从图9 可知， 在微生物分泌的蛋白酶的作用下，咸鸭蛋蛋清具有抗脂质过氧化能力的基团逐渐暴露出来，表现出了一定的抗氧化活性[26]。但从抑制脂质过氧化能力来看，发酵组组分Ⅱ、Ⅲ的IC50值相较于对照组来说并不是很优秀，对空白组而言却有质的突破。 发酵组组分Ⅰ检测不到活性的原因，猜测是因为具有抗氧化活性的小肽含量相对较少，且复杂的环境成分对实验有一定的干扰。 由此可得出，耐盐菌发酵有助于增强咸蛋清蛋白的抑制脂质过氧化能力。

2.2.5 发酵产物还原力测定具有抗氧化能力的物质提供的电子， 能使Fe3+还原成Fe2+，K3Fe（CN）6在还原剂的作用下被还原成K4Fe（CN）6，与Fe3+反应能形成普鲁士蓝，其在700 nm 附近有强吸收峰[27]。

还原力是基于加入发酵离心产物 （还原性物质）后，体系中Fe3+转化为Fe2+来检测的，吸光值越大样品的还原力越强。 如图10 所示，VC 当量越大表明样品还原力越强，比较发酵组组分Ⅱ、Ⅲ可知，其还原力与相对分子质量大小呈负相关，相对分子质量在3 000 以下， 在蛋白酶的作用下一些极性或带电的氨基酸侧链较多地暴露出来[28]，从而增加了还原能力。 比较发酵组的组分Ⅱ、Ⅲ，其还原力随相对分子质量的减小而增强，这与Guillen G 等人[29]的研究结果一致。 空白组的三个组分均检测不出还原能力。 由此可得出，耐盐菌发酵后能增强咸蛋清蛋白的抗氧化活性。

图10 发酵产物体外还原力Fig. 10 Reducing ability of different fermentation samples in vitro

3 结 语

从金华火腿中筛选得到的耐盐菌，37 ℃振荡发酵48 h，6 000 r/min 离心取沉淀物， 蛋白质质量分数约为12%，与新鲜鸭蛋清无异，但盐质量分数仅剩3%左右， 脱盐率能达到70%， 相较于咸鸭蛋清10%的含盐质量分数大大降低；冻干后，盐质量分数15%~18%，大大低于咸蛋清38%；粗蛋白质量分数55%~58%，略高于咸蛋清49%。

沉淀物加水振荡复溶， 取上清液分别经过10 000 和3 000 的超滤膜离心分离， 得到小于3 000 及3 000~10 000 的物质，通过四个体外抗氧化活性体系共同得出， 咸鸭蛋蛋清在发酵过程中，耐盐菌产生的蛋白酶能在较高盐质量分数的环境中有效地降解蛋清蛋白， 经过3 000 的超滤膜离心后得到小于3 000 的小肽，具有极强的抗氧化活性。