用于丁酸香叶酯合成的褶皱假丝酵母脂肪酶固定化

王 璐， 冯 骉

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）甘油三酰酯水解酶是一类重要的工业酶，可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油以及甘油一酯和甘油二酯，广泛存在于动物、植物各种组织及微生物中，是最早研究的酶类之一[1]，在有机溶剂中，它还可以催化转酯化、酯类逆向合成、聚合物合成、生物活性剂合成以及药物合成等反应。 利用一些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分[2]和手性药物的合成[3]已成为酶工程领域新的研究热点。 脂肪酶及其改性制剂在食品、化工、造纸、油脂以及制药等行业已得到广泛应用。

丁酸香叶酯天然存在于薰衣草油等精油中，主要用作玫瑰、金合欢、天竺葵、铃兰、香叶、薰衣草等香精的调和香料，也用于食品香精的调配中，如冰淇淋、口香糖、糕点、糖果等。 其用途虽广，但天然来源有限[4]，目前主要依靠工业合成。 传统的合成方法是化学合成，得到的是混合物，后续分离的成本较高；且由于使用浓硫酸作催化剂，存在严重腐蚀设备及需要三废处理等缺点[5]。 酶法因反应条件温和、转化率高和无副反应等优势受到研究者的青睐。 在国内，肖彬曾报道使用酶法合成丁酸香叶酯，酯化率达到92%[6]， 但未具体说明实验方法以及所用的酶，且没有后续报道。 国外对脂肪酶催化合成丁酸香叶酯的研究多一些，随着合成方法以及选用酶的不同，酯化率差异较大。 Chwen-Jen Shieh 利用脂肪酶AY 催化三丁酸甘油酯与香叶醇进行转酯化反应生成丁酸香叶酯，并通过响应面法和五水平五变量中心复合旋转设计法，确定最佳反应条件，最终摩尔酯化率为96.8%[7]。 Sylviane Pulvin 利用毛霉酯酶催化合成丁酸香叶酯，研究水分活度与酶活性的的关系，最高酯化率可达到75%[8]。

褶皱假丝酵母脂肪酶 （Candida rugosalipase，CRL）对人类和其他生物都是安全和无副作用的，并且已实现商品化， 广泛应用于医药、 油脂加工、食品、日化等工业，是目前为止全世界工业中应用最广泛的商品化脂肪酶之一。 然而，游离态酶在应用过程中存在易结块、易失活、不易回收、难以重复利用等问题，而且脂肪酶的价格较高，不利于推广应用。 为了降低脂肪酶的使用成本，提高其稳定性和活力，实现连续化生产，许多研究者开展了固定化脂肪酶的研究，Jasmina J. Damnjanovic 利用Sepabeads®EC-EP 树脂对CRL 固定化， 反应48 h酯化率为99%[9]。 对于脂肪酶的固定化，国内外的研究重点主要集中在固定化载体的选择与固定化条件的优化上[10]，而载体大多为多孔和大孔材料[11]。 其中大孔离子交换树脂和吸附树脂吸附脂肪酶，具有吸附容量大、机械强度高、再生处理方便等优点，且吸附法处理条件温和，酶活损失少[12-13]。 本研究选用不同规格的大孔树脂为载体，以酶的固定化率和固定化酶催化丁酸香叶酯合成的酯化率为目标，选出最佳载体，然后考察酶液浓度、pH 和温度对固定化的影响，从而优化固定化过程。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂褶皱假丝酵母脂肪酶、 香叶醇（≥98%）及正己醇（色谱纯）：购于Sigma 公司；大孔吸附树脂DA201-V、 大孔离子交换树脂D151、D152、D311：均购于勤实科技公司；牛血清蛋白：生化试剂；Na2HPO4、NaH2PO4、3Å 型分子筛、 丁酸、正庚烷等：分析纯试剂，均购自国药集团上海化学试剂公司。

1.1.2 实验设备DKZ-450B 型电热恒温振荡水槽；真空干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；磁力搅拌器：德国IKA 公司；pH 计：XS204 精密天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；Anke TGL-16C 离心机： 上海安亭科学仪器厂；UV-1800 紫外可见分光光度计：GC-2014，日本岛津公司；高效液相色谱-半制备：沃特世科技（上海）有限公司；FTIR-iS50 型傅里叶红外光谱仪： 美国Nicolet 公司；AduanceⅢ400MHz 型全数字化核磁共振波谱仪： 德国布鲁克AXS 有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理大孔吸附树脂：将树脂用去离子水清洗，去杂，采用乙醇浸泡过夜，最后用去离子水冲洗至中性备用。

阳离子交换树脂： 将树脂用去离子水浸泡胀润，去杂，用2%~4%NaOH 浸泡4~8 h 后用去离子水洗至中性，再用4%盐酸浸泡4~8 h，用去离子水洗至pH 6，备用。

阴离子交换树脂： 将树脂用水洗至流出清水后，用4%盐酸浸泡4~8 h，用去离子水洗至pH 6，再用2%~4%NaOH 浸泡4~8 h，用去离子水洗至pH 7~9，备用。

1.2.2 脂肪酶的固定化称取一定量的CRL，溶解于设定pH 值的0.05 mol/L 磷酸缓冲液中， 低速搅拌30 min，并在2 400 r/min 下离心3 min，移取一定量上清液于具塞三角烧瓶中，再加入预处理后经真空抽滤过的湿树脂，放在恒温振荡水槽中，在150 r/min下振荡8 h；取上清液测定酶蛋白含量，并用一定量0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗三次， 抽滤分离固定化酶，真空干燥，收集后于4 ℃条件下保存待用。

1.2.3 固定化脂肪酶催化合成丁酸香叶酯将3 Å分子筛置于500 ℃马弗炉中活化6 h， 慢慢冷却后加入正庚烷中过夜。

将丁酸与香叶醇按1∶1.5 比例加入到预先装有10 mL 溶剂的棕色瓶中，加入100 mg 分子筛，在温度为40 ℃的恒温振荡水槽中振荡10 min。 加入固定化脂肪酶，在200 r/min 振荡速度下反应，于不同的时间点取100 μL 反应液，吸取100 μL 的正己醇溶液作为内标，加入溶剂稀释至1 mL，取1 μL 进行气相色谱检测。

1.2.4 丁酸香叶酯的分离鉴定反应产物经0.22 μm 有机膜过滤，每次取200 μL 进行液相色谱分离制备。 取得少量纯品进行红外以及核磁检测。

液相色谱条件： 色谱柱XBridge TM Prep C18（10 mm×250 mm，5 μm），流动相80%乙腈-20%水，流速3 mL/min，柱温25 ℃，紫外检测波长220 nm，进样量200 μL。

傅里叶红外光谱分析：采用美国Nicolet 公司的FTIR-iS50 型傅里叶红外光谱仪， 将丁酸香叶酯和溶剂分别滴于溴化钾晶体上压制成片，在室温下测定样品的吸收光谱， 扫描光谱范围为4 000～400 cm-1，分辨率为2.0 cm-1。

核磁共振检测： 溶剂为CDCl3， 观测频率为100.625 MHz，采用Waltz 去偶技术，观测谱宽24 038 Hz。

1.2.5 蛋白质含量的测定蛋白质含量分析采用Bradford 法[14]，以牛血清蛋白为标准蛋白质。 按下式计算酶的固定化率：

固定化率=（初始酶液总蛋白质质量-残液总蛋白质质量） /初始酶液总蛋白质质量×100%

1.2.6 气相色谱定量检测丁酸香叶酯采用内标法进行样品的定量分析，内标物为正己醇。

校正因子的测定： 分别配置0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mol/L 的正己醇与丁酸香叶酯溶液， 采用GC 准确测量正己醇与丁酸香叶酯的峰面积， 以进样量对峰面积进行线性回归， 求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。 校正因子计算公式如下：

式中：mi为丁酸香叶酯质量；ms为正己醇质量；Ai为丁酸香叶酯峰面积；As为正己醇峰面积。

标准样品的配置：吸取30 μL 正己醇加入有机溶剂中，总体积为5 mL，混匀。

样品溶液的配置：吸取100 μL 标样，100 μL 反应样液，加入800 μL 溶剂中，混匀后经0.22 μm 有机膜过滤，取1 μL 进行检测。

气相检测条件：岛津GC-2014 色谱仪，色谱柱DB-Wax（30 m×0.25 mm），载气为N2，程序升温条件为100 ℃保留1 min，10 ℃/min 升温至220 ℃保留10 min。柱流量1.15 mL/min，分流比30∶1，检测器温度260 ℃。

丁酸香叶酯酯化率定义为产物中丁酸香叶酯量与理论上完全酯化时丁酸香叶酯量之比。

2 结果与讨论

2.1 树脂载体对固定化脂肪酶的影响

各种树脂对酶固定化的适应性不同，各种酶又具有不同的肽段和不同的极性，从而对树脂载体的结合性有特定的要求。 工业上常用离子交换树脂和大孔吸附树脂作为固定化酶的载体，作者选取了具有代表性的几种吸附树脂和离子交换树脂，比较固定化作用效果，筛选出适合褶皱假丝酵母脂肪酶固定化的树脂载体。

在下述条件下进行固定化：取1 g 树脂，酶液浓度10 mg/mL，缓冲液pH 6.0，温度30 ℃，吸附8 h，固定化后的酶用于丁酸香叶酯的合成反应。 考察不同树脂的固定化率和固定化后酶催化丁酸香叶酯合成的酯化率， 结果分别见表1 和图1。 从表1 可知，这几种树脂都有固定化效果，效果最好的D151树脂固定化率达到83%，而D311 和DA201-V 两种树脂的固定化率都比较低，说明大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂和弱极性大孔苯乙烯型吸附树脂均不适于CRL 的固定化。

另一方面，固定化率这一指标仅表示蛋白质被固定化的程度， 并不等价于酶活力的固定化效果，因此将固定化酶用于催化丁酸香叶酯的合成，从酯化率的角度进一步作比较。 从图1 的结果看，阳离子交换树脂D151 和D152 不仅蛋白质固定化率高，酯化率也比其余两种树脂高。 吸附树脂与阴离子交换树脂相比，固定化率接近，但阴离子交换树脂的酯化率明显低于吸附树脂。 阳离子交换树脂固定化率和酯化率高的原因可能是：因为离子交换树脂依靠表面功能基团与脂肪酶作用，形成化学键，其结合力较强，与吸附结合力相比，使酶不易脱落，还可以使酶更好地暴露在载体外面，增加酶分子与底物分子的作用几率，最大限度地降低酶分子的作用位阻[15]。 而吸附树脂为弱极性树脂，无功能基团，对于脂肪酶的吸附仅靠其较大的表面积， 作用力比较弱，导致固定化率较低，且酶在内表面的吸附使酶分子被包埋在载体里面，就增加了空间位阻。 阴离子交换树脂固定化率和酯化率都低的原因可能是褶皱假丝酵母脂肪酶是一种碱性蛋白质，而阴离子交换树脂适于选择性地作用于酸性物质。 总之，大孔阳离子交换树脂D151 固定化效果最好。

表1 各种树脂的固定化率Table 1 Immobilization ratio of different resins

图1 各种树脂固定化后的酶催化丁酸香叶酯合成的酯化率Fig. 1 Esterification ratios of geranyl butyrate catalyzed by enzyme immobilized with different resins

2.2 酶液质量浓度对固定化的影响

每一种固定化酶载体的固载量是一定的，如果在固定化的过程中加入的酶量超过载体固载量，造成载体分子表面吸附酶量过多，就会使酶分子相互聚集成团，酶的活性中心有可能被遮盖，尽管吸附酶量较多，但酶的催化活性仍较低[16]。

取1 g D151 树脂，酶液质量浓度分别为10、15、20、25 mg/mL，缓冲液pH 6.0，在30 ℃下吸附8 h。酶固定化后即用于催化丁酸香叶酯的合成。 考察酶液质量浓度对固定化率和丁酸香叶酯合成效果的影响，结果见表2 和图2。随着酶液质量浓度的增加，固定化率先增大后减少， 在酶液质量浓度20 mg/mL 时达到最大值，说明此时大孔树脂集团的结合位点已趋于饱和。总体而言，固定化率的数值都比较高。而从酯化率角度看， 虽然酶液质量浓度20 mg/mL 时的固定化率最高，但给酶量已经过多，空间位阻效应显著，导致酶的活性中心被掩盖，酯化率低于酶液质量浓度10 mg/mL 和15 mg/mL 时的酯化率。 两项指标综合考虑， 选择15 mg/mL 为最适酶液质量浓度。

表2 不同酶液浓度下的固定化率Table 2 Immobilization ratiosat different enzyme concentrations

图2 固定化时酶液质量浓度对酯化率的影响Fig. 2 Effect of enzyme concentration during immobilization on esterification ratio

2.3 pH 对固定化的影响

酶分子能够“记忆”进入固定化前所在缓冲液的pH 状态，这种“记忆”pH 改变了酶分子所处的微环境，影响到酶分子相关功能基的解离，从而影响酶的酯化活性[17]，因此应选择合适的固定化pH。

取1 g D151 树脂，酶液质量浓度15 mg/mL，缓冲液pH 分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在30 ℃下吸附8 h， 然后将固定化酶用于催化丁酸香叶酯的合成。研究不同pH 对丁酸香叶酯固定化效果的影响，结果见表3 和图3。 由表3 可知，当pH 低于6.5 时，固定化率较高， 说明弱酸条件下褶皱假丝酵母脂肪酶与载体的亲和吸附作用较强。 观察酯化率，在pH 6.5下固定化时酯化率最高， 因为只有在特定pH 值下，酶分子上的活性基团才能处于最佳离子状态，所以选择6.5 为最适的固定化pH。CRL 在弱酸环境下固定时具有更高的酯化活性，反映了该酶作为弱碱性脂肪酶的特点。

表3 不同pH 下的固定化率Table 3 Immobilization ratios at different pH

图3 pH 对酯化率的影响Fig. 3 Effect of pH on esterification ratio

2.4 温度对固定化脂肪酶的影响

取1 g D151 树脂，酶液质量浓度15 mg/mL，缓冲液pH 6.5，分别在温度30、35、40、45、50、55 ℃下吸附8 h，固定化后酶用于催化丁酸香叶酯的合成。表4 和图4 表示了不同固定化温度对固定化效果的影响。 表4 表明，从30～45 ℃，固定化率随温度的升高而增加，而从45～60 ℃，则随温度的升高，逐渐降低。 这归因于蛋白质的吸附是一个吸热过程，在温度较低时，酶不容易吸附到树脂上，随着固定化温度的升高，分子运动逐渐加剧，载体对酶的吸附量有所提高。 然而，高温又容易使蛋白质变性失活，所以继续升高温度，固定化率反而下降。 45 ℃下进行固定化的效果最好。 从图4 看，也是45 ℃下固定化的酶的酯化率最高，其原因一方面是在一定的范围内， 温度的升高能提高酶与底物的反应速度；而另一方面，温度较高时蛋白质构象改变，酶分子发生不可逆失活，导致酯化率降低。 两方面因素拮抗的结果，45 ℃为固定化的最适温度。

表4 不同温度下的固定化率Table 4 Immobilization ratios at different temperatures

图4 固定化温度对酯化率的影响Fig. 4 Effect of immobilization temperature on esterification ratio

2.5 验证试验

根据以上单因素考察的结果，得到以下条件：1 g D151 树脂，酶液质量浓度15 mg/mL，缓冲液pH 6.5，温度45 ℃，吸附8 h。在这些条件下进行验证实验，结果见图5。 实验结果表明，在上述优化后的反应条件下，酯化率可达84%。

2.6 定性分析

2.6.1 丁酸香叶酯的红外光谱表征图6 所示为丁酸香叶酯的红外光谱图， 在1 735 cm-1处出现中等宽度的强吸收峰，代表了酯（-COO-）上的C=O 伸缩振动，1 173 cm-1处代表酯键中C-O 的振动吸收峰，1 670 cm-1处的弱吸收峰代表-C=C-的的伸缩动，3 000 cm-1附近的吸收峰为C-H 键振动， 丁酸香叶酯的官能团在此光谱图上已全部显示。

2.6.2 丁酸香叶酯的核磁表征图7 为丁酸香叶酯的碳谱谱图， 共有14 个有效峰， 其中4 个伯碳峰、5 个仲碳峰、4 个烯碳峰和一个羰碳峰。 归属δ13.68、16.46、17.69、25.67 分别为1 位、8 位、13 位、14 位甲基伯碳。δ18.51、36.29、61.17、39.55、26.32 分别 为2 位、3 位、5 位、9 位、10 位 亚 甲 基 仲 碳。δ118.48、123.79 分 别 为6 位、11 位 一 取 代 烯 碳。δ142.09、131.81 分 别7 位、12 位 二 取 代 烯 碳。δ173.73 为4 位羰碳，77 处的三个 峰为CDCl3溶剂峰。

综合两种定性方法的结果，可确定产物确为丁酸香叶酯。

图5 最适固定化条件下的酯化率验证Fig. 5 Verification of esterification ratio with optimal immobilization conditions

图6 丁酸香叶酯的红外光谱Fig. 6 FT-IR spectrum of geranyl butyrate

图7 丁酸香叶酯核磁共振图谱Fig. 7 13C- NMR spectrum of geranyl butyrate

3 结 语

大孔阴阳离子交换树脂和吸附树脂都对CRL有一定的固定化作用，但阳离子交换树脂的固定化性能最好，符合阳离子交换树脂作用于碱性物质的原则。 树脂的固定化性能与功能基团的含量等多种因素有关，并非固定化率越高，酶的活性越高。 CRL适宜在弱酸环境下固定， 可显示更高的酯化活性。在45 ℃下固定化的CRL 能得到高的酯化率。

以D151 离子交换树脂为载体， 固定化的最佳条件为：每克预处理过的树脂加酶15 mg/mL，在pH 6.5 缓冲液下，温度为45 ℃，吸附8 h 得到的固定化酶催化合成丁酸香叶酯，最高酯化率达到84%。