利用CRISPR/Cas9技术构建OAS2敲除的PK-15细胞系及敲除OAS2对CSFV复制的影响

张越秀，张华伟，李连峰，仇华吉

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由 CSF 病毒(CSFV)引起的一种严重危害养猪业的烈性动物传染病。天然免疫系统是机体抵抗外来病原感染的第一道防线，其中干扰素(IFN)和干扰素刺激基因(ISGs)在宿主抗病毒防御中发挥关键作用[1]。CSFV 感染宿主后，激活I 型IFN (IFN-I)信号通路，引起下游ISGs 的转录表达，进而发挥抗CSFV 作用。

2'-5' 寡腺苷酸合成酶(OAS)家族成员是IFN 诱导产生的抗病毒蛋白，IFN-I 和IFN-Ⅱ均能够诱导机体产生OAS 家族蛋白。猪源OAS 家族包括3 个成员：OAS1、OAS2 和OASL。OAS 家族包含保守的2'-5' 寡腺苷酸(2-5A)合成酶合成域(OAS)单元，其中OAS2 含有2 个OAS 单元。OAS2 抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒的复制[2-3]；其抗病毒功能主要是利用ATP 催化合成2-5A，随后2-5A 激活核糖核酸内切酶(RNase L)，活化的RNase L 降解胞内的病毒RNA 和细胞RNA，从而导致病毒感染过程中宿主细胞内蛋白的合成受到抑制，病毒的增殖随之受到抑制[4-5]。本实验室前期利用表达萤火虫荧光素酶的报告病毒感染过表达猪源ISGs 的PK-15 细胞系，筛选到猪源OAS 家族成员OAS1 和OASL，并且它们具有抗CSFV 的作用[6]，后续研究中，本实验室进一步探究猪源同家族成员OAS2 对CSFV 复制的影响。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)是一种由RNA指导Cas 核酸酶对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术，即通过人工优化的具有引导作用的单链RNA(Guide RNA，gRNA)引导核酸酶Cas 蛋白在与 gRNA 配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA 双链断裂，进而利用生物体内非同源末端修复机制或同源重组机制修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失[7]。本研究利用CRISPR/Cas9 技术获得OAS2基因敲除的猪肾(PK-15)细胞系，并利用该敲除细胞系研究敲除OAS2 对CSFV 复制的影响，为进一步阐明OAS2 抗CSFV 复制的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人胚肾细胞(HEK293T)、PK-15 细胞由本实验室购买并保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自TaKaRa 公司；慢病毒载体Lenti-CRISPRv2 及辅助质粒 psPAX2、pMD2.G 购自 Addgene 公司；CSFV 石门(Shimen)株 AF092448.2、表达海参荧光素酶(Rluc)的重组报告猪瘟病毒rCSFV-Rluc 由本实验室保存。

限制性内切酶BsmBⅠ、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；TRIzol、AMV 反转录酶、RNA 抑制剂 RRI和 Premix ExTaqTMMix 购自 TaKaRa 公司；X-treme GENE HP DNA 转染试剂购自Roche 公司；质粒小量提取试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、DNA 提取试剂盒和质粒大提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；CCK-8 试剂盒购自Dojindo公司；双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自Promega 公司；荧光素酶检测白板购自Corning 公司；BCA 法测定蛋白质浓度试剂盒购自Solarbio 公司；鼠源抗Flag 标签单克隆抗体(MAb)、鼠源抗β-actin MAb 和兔源抗 OAS2 多克隆抗体(PAb)购自Sigma-Aldrich 公司；FITC 标记的山羊抗兔和抗鼠IgG 均购自LI-COR Bioscience 公司；引物由吉林库美有限公司合成。

1.2 LentiCRISPRv2-sgRNA 敲除质粒的构建与鉴定 根据NCBIOAS2基因组(NO：595128)信息，标注外显子。将OAS2基因第1、第2 外显子(Exon)核苷酸序列输入sgRNA 在线设计网站(http://crispr.mit.edu)，选择两条脱靶率最低的sgRNA 基因序列，分别命名为：sgRNA-E1 和sgRNA-E2。

按照LentiCRISPRv2 载体信息以及选定的sgRNA 基因序列，设计特异性引物(表1)，通过程序性退火将 sgRNA 引物合成双链 DNA；载体 Lenti-CRISPRv2 经BsmBⅠ酶切后回收线性化的载体。用T4 DNA 连接酶将退火后的sgRNA 双链DNA 与线性化的LentiCRISPRv2 在室温连接30 min 获得重组质粒，分别命名为pLentiCRISPRv2-sgRNA-E1 (psgRNA-E1)和 pLentiCRISPRv2-sgRNA-E2 (psgRNA-E2)，经测序鉴定正确后用于慢病毒包装。

表1 靶向OAS2 基因的sgRNA 序列Table 1 The sequence of sgRNA targeting OAS2 gene

1.3 不同sgRNA 对OAS2基因切割效果的检测将HEK293T 细胞接种于6 孔细胞板中，待细胞汇合度达到80%时转染，分为4 个组：pFlag-OAS2+psgRNA-E1；pFlag-OAS2+psgRNA-E2；pFlag-OAS2+psgRNA-E1+psgRNA-E2 和 pFlag-OAS2+pLentiCRISPRv2(阴性对照)。转染36 h 后，裂解细胞收集蛋白样品，BCA 法测定蛋白浓度后，经SDS-PAGE 凝胶电泳检测Flag-OAS2 蛋白的表达。分别以鼠源抗Flag MAb (1∶1 000 倍)和鼠源抗 β-actin MAb (1∶1 000)为一抗，山羊抗鼠IgG-FITC (1∶10 000)为二抗，western blot 检测sgRNAs 对OAS2 基因的切割效率。同时，采用LI-CO Odyssey 红外影像扫描仪分析蛋白的灰度值。

1.4OAS2基因敲除的PK-15 细胞的制备及筛选将HEK293T 细胞接种于6 孔细胞板中，待细胞汇合度达到80 %时，将 psgRNA-E1、psgRNA-E2 (实验组)分别与辅助质粒 psPAX2 和 pMD2.G 按 2.1 μg、1.4 μg 和 0.7 μg 共转染，同时以 pLentiCRISPRv2(对照组)与辅助质粒psPAX2 和pMD2.G 按照相同方式其转染作为阴性对照。转染48 h 后收集慢病毒备用。将状态良好的PK-15 细胞传代接种于6 孔细胞板中，待细胞汇合度达到80 %时，将慢病毒以MOI 1 的剂量接种PK-15 细胞进行转导，36 h 后，用2.5 μg/mL 的嘌呤霉素(puro)进行压力筛选，经两轮puro 筛选，对照组细胞全部死亡后，将实验组细胞消化成单个细胞，经细胞计数后滴定单克隆，挑取单克隆细胞并扩大培养，细胞系传代后冻存备用。

1.5 PK-OAS2-KO 细胞株OAS2基因及其蛋白敲除的检测 收集单克隆细胞株，编号后按照DNA提取试剂盒说明书提取细胞的基因组DNA。依据sgRNA 靶向的OAS2基因组序列位点，根据其相应外显子两端的内含子基因序列设计特异性鉴定引物(表2)，以此为引物，以提取的细胞基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增。PCR 产物经测序及序列比对，检测所获单克隆细胞株OAS2基因的敲除效果。

表2 鉴定OAS2 基因敲除的引物序列Table 2 Primer sequence for detecting OAS2 gene knockout

将鉴定为OAS2基因敲除的单克隆细胞株(PK-OAS2-KO)和对照组细胞(PK-Cas9)接种于 6 孔细胞板中，待细胞贴壁后采用1 000 IU/mL IFN-α 刺激12 h，裂解细胞收集蛋白样品，同时设无IFN-α刺激对照。SDS-PAGE 凝胶电泳检测内源性OAS2蛋白的表达水平，以兔源抗OAS2 PAb (1∶500)和鼠源抗β-actin MAb (1∶1 000)为一抗，山羊抗鼠和山羊抗兔 FITC-IgG (1∶10 000)为二抗，western blot 检测OAS2 蛋白的敲除效果。同时以野生型PK-15 细胞做上述处理后作为对照。

1.6 敲除 OAS2 对 CSFV 复制的影响 将 PKOAS2-KO 和 PK-Cas9 细胞计数后，以 1×104个细胞/ 孔接种96 孔板，每种细胞设置5 个重复孔；待细胞汇合度达到80 %时，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃培养 2 h 后，测定 PK-OAS2-KO 和 PKCas9 细胞的OD450nm值，并计算PK-OAS2-KO 和PKCas9 的细胞活力。

将 MOI 0.01 的 rCSFV-Rluc 感染 PK-OAS2-KO和PK-Cas9 细胞，感染病毒24 h 后，弃掉细胞培养上清，每孔加入100 μL 1 Luc 裂解液，裂解 1 h，吸取细胞裂解产物于1.5 mL EP 管中，离心收集上清备用。荧光素酶检测白板每孔加入30 μL STOP Buffer (海肾荧光素酶检测底物)，取30 μL 裂解上清液与底物混匀后，将白板放入多功能聚焦式荧光分析仪中读取荧光值，检测rCSFV-Rluc 的复制水平。

将 MOI 0.01 的 CSFV Shimen 株感染 PK-OAS2-KO 和PK-Cas9 细胞，感染病毒24 h 后，采用TRI-zol 法提取感染细胞的RNA，反转录为cDNA，然后利用本实验室构建的荧光定量PCR (qRT-PCR)方法定量检测细胞中CSFV 基因组拷贝数[8]。

1.7 数据处理 采用SPSS 20.0 软件对所有实验数据进行Student 氏t检验或方差分析。其中，***：p＜0.001；**：p＜0.01 为差异极显著；NS：p＞0.05，没有统计学意义。

2 结 果

2.1 LentiCRISPRv2-sgRNA 敲除质粒的构建与鉴定 将退火获得的sgRNA 双链序列克隆至Lenti-CRISPRv2 载体，构建重组质粒psgRNA-E1 和psgRNA-E2。经测序鉴定表明正确构建了含有sgRNA 的重组质粒，构建模式见图1。

图1 pLentiCRISPRv2-sgRNA 的构建模式图Fig.1 Schematic diagram of the pLentiCRISPRv2-sgRNA

2.2 不同sgRNA 对OAS2基因敲除效果的检测结果 将 pLentiCRISPRv2-sgRNAs 与过表达 OAS2 的真核表达质粒pFlag-OAS2 共转染HEK293T 细胞，经western blot 检测Flag-OAS2 的表达水平并分析蛋白的灰度值。结果显示，sgRNA-E1 和sgRNA-E2 均能够有效地降低OAS2 蛋白表达(图2)，表明设计的sgRNA 具有较高的敲除效率。

图2 sgRNA 敲除 OAS2 蛋白的 western blot 鉴定结果(A)和灰度值分析(B)Fig.2 Identification of OAS2 knockout efficiency by western blot(A) and grey value analysis (B)

2.3OAS2基因敲除细胞PK-OAS2-KO 的筛选与测序鉴定结果 将pLentiCRISPRv2-sgRNA 与辅助质粒psPAX2 和pMD2.G 共转染HEK293T 细胞获得的慢病毒感染PK-15 细胞，经Puro 加压筛选和有限稀释法最终获得18 株可能敲除OAS2基因的单克隆PK-15 细胞株，提取细胞的基因组DNA，扩增目的片段，测序结果显示得到1 株OAS2基因第2 外显子缺失突变的PK-15 细胞株PK-OAS2-KO。将测序结果比对显示，PK-OAS2-KO 细胞与野生型PK-15细胞相比，在第2 外显子位置有2 bp 碱基的缺失突变(图3)，从基因水平表明 PK-OAS2-KO 细胞中OAS2基因发生移码突变。

图3 PK-OAS2-KO 细胞中OAS2 基因缺失的测序鉴定结果Fig.3 Sequence identification of OAS2 gene in PK-OAS2-KO cells

2.4OAS2基因敲除细胞PK-OAS2-KO OAS2 蛋白敲除的鉴定结果 收集PK-OAS2-KO、PK-Cas9和PK-15 细胞的蛋白样品，经western blot 检测结果显示，PK-15 细胞中OAS2 蛋白表达丰度高，经IFN-α 刺激后，OAS2 蛋白表达量稍有提高，表明OAS2 是一种ISG 分子；与PK-Cas9 细胞相比，PKOAS2-KO 细胞有无 IFN-α 诱导，OAS2 蛋白均未表达(图4)，表明OAS2基因的缺失突变导致OAS2 阅读框的紊乱，使PK-OAS2-KO 细胞不表达OAS2 蛋白。

图4 PK-OAS2-KO 细胞中OAS2 蛋白表达水平的检测Fig.4 Detection of OAS2 expression in PK-OAS2-KO cells

2.5 敲除 OAS2 对 CSFV 复制影响的检测结果利用CCK-8 细胞活力检测试剂盒检测PK-OAS2-KO和PK-Cas9 细胞的活性，结果显示两种细胞具有相似的生长活力(图5A)。之后，分别通过荧光素酶活性检测试验和qRT-PCR 检测敲除OAS2 对CSFV 复制的影响，结果显示，与PK-Cas9 对照细胞相比，PK-OAS2-KO 细胞内的海肾荧光素酶活性(p＜0.001)(图5B)和病毒基因拷贝数(p＜0.01) (图5C)均显著增加，表明敲除OAS2 可促进CSFV 复制。

图5 敲除OAS2 对CSFV 复制影响的检测结果Fig.5 The impact of OAS2 knockout on the replication of CSFV

3 讨 论

本研究采用CRISPR/Cas9 系统，分别设计了靶向OAS2 基因第1 和第2 外显子的sgRNAs，将sgRNAs 序列插入LentiCRISPRv2 载体，获得重组质粒。将重组质粒与辅助质粒共转染HEK293T 细胞，获得携带sgRNA 的慢病毒，将重组慢病毒转导PK-15细胞，采用puro 筛选分离得到单克隆细胞株，经基因测序和western blot 鉴定，表明正确构建了敲除OAS2 基因的 PK-15 稳定细胞系。将 CSFV 感染PK-OAS2-KO 细胞系，结果表明敲除OAS2 促进CSFV 复制。本研究为构建CSFV 的其它基因敲除的PK-15 细胞系提供了参考，并为进一步阐明OAS2抗CSFV 的作用机理奠定基础。

猪源OAS 家族包括3 个成员：OAS1、OAS2 和OASL。前期实验已证实猪源OAS1 和OASL 均能够抑制CSFV 的复制[9]，本实验显示敲除OAS2 促进CSFV 复制，表明猪源OAS 家族均能够抑制CSFV复制。其中，OASL 不是依赖于经典的OAS/RNase L 通路发挥抗病毒作用，而是通过促进MDA5 介导的 IFN 信号通路发挥抗 CSFV 作用[9]；OAS1 和OAS2 抑制CSFV 复制的机制还不明确，有必要进一步探究其是否依赖于经典的OAS/RNase L 通路而发挥抗CSFV 作用。

CRISPR/Cas9 系统是一种高效、方便的基因编辑工具，具有操作简单、基因修饰率高、可遗传和实验成本低等优点[10]。与小RNA 干扰技术相比，CRISPR/Cas9 系统是在DNA 水平对OAS2 基因进行编辑，完全沉默了OAS2 的表达；与shRNA 相比，CRISPR/Cas9 系统克服了用慢病毒转导细胞引发的突变及不稳定表达的缺点。但是，由于受到sgRNA识别位点特异性及某些基因结构复杂性的限制，CRISPR/Cas9 系统还面临着脱靶的问题，在一定程度上限制了其在基因功能研究方面的应用[11]，但随着CRISPR/Cas9 系统的不断优化以及新的Cas 系统的出现，其应用范围将更加广泛。