溶血性曼氏杆菌白细胞毒素研究进展

张继鑫，彭远义，李能章

(西南大学动物科技学院，重庆北碚400715)

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，Mh)是一种革兰氏阴性短杆菌，可作为常在菌定植于牛羊上呼吸道，但在应激条件下，能够引起牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)、羊肺炎和新生羔羊急性败血症等多种牛羊疾病。溶血性曼氏杆菌病导致的临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎、胸膜肺炎为主，对牛羊养殖业造成了重大的经济损失，仅北美，Mh 给肉牛养殖业造成的经济损失就高达数十亿美元[1]。Mh 按荚膜抗原分型可分为12 种血清型(A1、A2、A5～A9、A12 ～A14、A16、A17)，其中以荚膜血清型 A1、A2、A6 最为常见。Mh 含众多毒力因子，包括白细胞毒素(Leukotoxin，Lkt)、荚膜、脂多糖、黏附素、外膜蛋白及多种金属蛋白酶等，其中Lkt 为Mh 最重要的毒力因子[2]。

Lkt 对热不稳定，在Mh 对数生长期时分泌最多[3]。Lkt 为RTX (Repeats in toxin)毒素家族成员，其它家族成员包括如大肠杆菌的HlyA，胸膜肺炎放线杆菌的Apx，百日咳杆菌的CyaA 等，它们在基因结构和蛋白结构上均具有一定相似性，但在宿主及靶细胞的特异性方面却各不相同[4]。Lkt 主要作用于反刍动物的白细胞，通过破坏先天性及适应性免疫系统进而促进Mh 的感染。基于目前对Lkt 的结构及功能的研究，本文将对Lkt 的遗传学特征、功能特性及其在疫苗中的应用进行综述，归纳总结对Lkt 的研究进展及尚未解决的问题，为对其后续研究提供思路，同时也为国内Mh 疫苗的研制提供参考。

1 Lkt的遗传学特征

1.1Lkt基因簇的构成及功能lkt基因簇由4 个基因构成(图1)，从5' 到3' 分别为lktC、lktA、lktB、lktD，与大肠杆菌溶血素操纵子基因(hlyCABD)具有一定的同源性，其编码的蛋白大小依次约为19.9 ku、102 ku、79.6 ku、54.7 ku[5]。LktA 为毒力效应蛋白，LktC 蛋白具有转酰酶作用，可以酰基化LktA 蛋白，目前认为，这种酰基化作用对于LktA 与靶细胞受体的结合是非必需的，但其是否是LktA 发挥细胞毒性所必需的还尚存争议[6-7]。LktB 和LktD 蛋白则负责将LktA 通过Ⅰ型分泌系统转运至胞外。

LktA 结构如图1 所示，LktA 包含953 个氨基酸，自N 端向C 端方向，前54 个aa 形成的双亲性结构域构成了线粒体靶向信号(Mitochondrial targeting signal，MTS)，参与介导Lkt 在胞内向线粒体的运输[8]；而后约aa169 处起含有一疏水结构域，该结构域参与了白细胞毒素的穿孔作用，包含8 个跨膜α 螺旋，其中4 个具有疏水性，4 个具有双亲性；随后是一个富含β 转角的结构域，使LktA 蛋白在此处形成了一个静态弯曲(Static bend)，将LktA 的酰基化结合位点暴露了出来，LktC 即与该处的赖氨酸残基相结合进行酰基的转移[7]；在该酰基化结合位点后，向C端继续延续，有一个高度保守，且富含甘氨酸(Gly)和天冬氨酸(Asp)，并且以重复的九肽序列L/I/F-X-G-G-X-G-ND-D-X 为基序的区域，该区域内含钙离子结合位点以及白细胞CD18 分子的配体，是LktA 发挥细胞毒性必不可少的功能域；在LktA 的C 末端共含229aa 的区域内，含有Lkt 中和抗原表位，以及最末端70aa 构成的LktB/D 的识别位点[9]。

图1 lkt 基因簇结构及LktA 结构域

1.2 Lkt 的多样性与特异性 为了更好的适应宿主环境，Mh 存在广泛的种间及种内DNA 水平转移和在宿主基因内重组现象，衍生出了复杂的lktCABD镶嵌结构，从而导致了Lkt 的多样性。不同宿主来源，及不同Mh 荚膜血清型之间，其lktA基因序列均可能存在一定差异。目前，按照lktA 等位基因突变情况，主要将lktA 分为8 种基因型，lktA1 ～lktA3、lktA6 ～lktA10，且lktA的基因型与Mh 的荚膜血清型存在一定关联，通常荚膜血清型A1 Mh含 lktA1，A7 Mh 含 lktA1 或者 lktA8，A2 Mh 含lktA2、lktA3、lktA8、lktA10基因型中的一种[10]。尽管不同lktA基因型Mh 所产生的LktA 在氨基酸序列及对靶细胞的细胞毒性方面存在一定差异，但不同基因型Lkt的Mh 之间仍具有交叉保护性，这也为研制基于Lkt 的Mh 疫苗奠定了理论基础[11-12]。

Lkt 的特异性取决于反刍动物白细胞表面的β2 整合素[4]。β2 整合素由 α 亚基(CD11)和 β 亚基(CD18)组成，根据其α 亚基的不同，可将β2 整合素分为3 种类型：淋巴细胞功能相关抗原1(Lymphocyte functions associated antigen 1，LFA-1；CD11a/CD18)；巨噬细胞 -1 抗原受体(Macrophage-1 antigen receptor，Mac-1；CD11b/CD18)；补体受体 4(Complement receptor 4，CR4；CD11c/CD18)。这3 种类型的β2 整合素均可以作为Lkt 的受体而介导对细胞的毒性[13]，但不论哪种类型的β2 整合素，它们均有一个共同的CD18 亚基，这也是当前公认的Lkt 的结合位点。而关于Lkt 与CD18 分子的具体结合位点，Dileepan等通过在人K562 细胞系共表达牛源CD11a，同时在细胞表面构建人- 牛嵌合CD18 后分别与Lkt 作用，显示Lkt是与CD18 分子aa541～aa581 片段相结合的[14]。但Shanthalingam 等通过在小鼠肥大瘤细胞系P815 及牛淋巴细胞系BL3 表面构建牛CD18 分子片段后与Lkt 作用，显示Lkt 结合位点在CD18 分子aa1～aa291 之间，进一步利用合成的CD18 分子小片段多肽竞争性结合Lkt，显示准确的结合位点是aa5～aa17，这一区域恰好也是CD18 分子的信号肽，而当该信号肽被切除后，Lkt 的细胞毒性也随之消失。同时，Shanthalingam 等还合成了 CD18 分子aa500～aa600 之间的小片段多肽，利用同样的竞争性结合的方法与Lkt 作用，结果显示该区域并无Lkt 的结合位点，因此，Shanthalingam 等认为Dileepan 等的结果存在一定问题，其不能反应Lkt 在反刍动物白细胞中的分子结合机制[15]。鉴于两者实验方法及细胞系的差异，本实验室更倾向于认为CD18 分子aa5～aa17 为Lkt 的结合位点，而至于另一亚基CD11 是否参与Lkt 与白细胞的结合作用，还有待进一步研究。

2 Lkt的功能特性

Lkt 能够以单体或多聚体的形式作用于白细胞，其对白细胞的作用呈现明显的剂量依耐性，通常可分为3 种：①极低浓度或亚细胞毒性浓度时可激活靶细胞，发生氧化迸发(Oxidative burst)及脱粒作用(Degranulation)等；②较低浓度时可诱导靶细胞凋亡；③高浓度时造成靶细胞细胞膜穿孔进而造成细胞肿胀坏死[16]。在这3 种作用中，Ca2+均起着重要的调节作用。研究表明，降低胞外和(或)胞内Ca2+浓度，或阻滞Ca2+通道，均能够有效降低Lkt 的细胞毒性[17]。同时，Lkt 的细胞毒性还取决于白细胞表面β2整合素的表达量，牛疱疹病毒感染会造成牛白细胞表面β2 整合素表达量增高，使得白细胞对Lkt 敏感性增强，这也是牛羊在感染某些病毒如牛疱疹病毒后，更容易感染Mh 的原因[18]。另外，Lkt 通常还会与脂多糖(LPS)以复合体的形式共同作用于白细胞，进而发挥更强的细胞毒性[19]。

2.1 Lkt 与白细胞激活 亚细胞毒性浓度的Lkt 与白细胞β2 整合素相结合后，可通过G 蛋白藕联受体介导胞内Ca2+浓度升高，从而激活白细胞，引起氧化迸发及脱粒作用等。另外，在中性粒细胞中，Lkt 还可激活磷脂酶代谢通路，产生具有趋化作用的类花生酸(如LTB4 等)等代谢产物[20]；Lkt 作用于巨噬细胞中，可激活NF-κB 信号通路，引起IL-1β、IL-8 及TNF-α 等细胞因子的分泌；而被Lkt 激活的肥大细胞、嗜酸性粒细胞可以产生血管活性物质及其他趋化因子，肥大细胞还可以产生组胺。这些类花生酸、细胞因子及趋化因子能够募集更多的中性粒细胞到炎症部位，引起炎性细胞浸润，并且IL-1β 还可刺激中性粒细胞表达更多的β2 整合素，进一步增加中性粒细胞对Lkt 的敏感性[21]，这些均为纤维素性渗出机制的研究奠定了细胞基础。体外实验显示，Lkt 可以抑制由刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)及美洲商陆有丝分裂原(Pokeweed mitogen，PWM)诱导的淋巴细胞增殖效应，而IL-1、IL-2可减轻这种抑制作用[22]，但具体机制仍未研究清楚，目前也还没有体内实验证实这一现象。

2.2 Lkt 与白细胞凋亡 尽管大多数细胞凋亡机制与钙Ca2+及钙调磷酸酶相关，但研究显示，Lkt 诱导中性粒细胞的凋亡可能在一定程度上并不依赖于Ca2+的内流，而是有多种途径参与。Praveen 等的研究显示，Lkt 可通过LFA-1、Caspase-3 和TNF-α 参与的凋亡途径诱导牛肺泡巨噬细胞凋亡[23]。Atapattu 等的研究显示Lkt 能够上调牛淋巴细胞系 BL3 Caspase-9 和促凋亡蛋白 Bad 及 Bax 的表达，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2、BclXL 和Akt-1 的表达，同时Lkt 还造成了线粒体外膜的损伤及膜电位的下降，引起细胞色素C 的外流，由此推测Lkt 引起的细胞凋亡可能依赖于线粒体-Caspase-9 途径[24]。进一步研究显示，LktA N端的前54aa 具有线粒体靶向信号(MTS)作用，当Lkt 被运送至线粒体外膜时，Lkt 通过转移酶TOM22 和TOM44 被转移至线粒体内，通过动力蛋白2 (Dynamin-2，DNM2)与亲环素D(Cyclophilin D，cyD)相结合，引起白细胞线粒体膜通透性改变，进而激活下游多种凋亡通路[8,25]。

2.3 Lkt 与白细胞坏死 高浓度Lkt 作用于白细胞，一方面可通过LFA-1 和Caspase-1 途径诱导巨噬细胞胀亡(Oncosis)[23]；另一方面可迅速引起细胞膜穿孔，初始孔径约0.9 nm，造成K+外流，Na+及Ca2+内流，导致细胞膜两侧渗透压失衡，大量水分进入细胞，使细胞迅速膨胀，随时间延长，细胞膜中的孔洞直径可达100 nm[26]，大量胞质内容物流出，并最终导致细胞膜降解，细胞坏死。流出的胞质内容物如乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、溶酶体酶等则会造成组织细胞的损伤，并最终导致组织功能障碍。

2.4 Lkt 的其它功能特性 Lkt 除了引起白细胞的凋亡与坏死外，Aulik 等的研究显示其还可以引起中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)和巨噬细胞胞外诱捕网(METs)的形成[27]。由DNA 骨架及镶嵌在其中的多种颗粒蛋白如髓过氧化酶、弹性蛋白酶、抗菌肽等组成的NETs 和METs，是一种有别于细胞凋亡与坏死的现象[28]，具有溶解Mh 毒力因子及捕获和杀灭Mh 的作用，同时也可能与纤维素性渗出有关。除上述Lkt 与白细胞的作用外，Lkt 还可引起溶血和血小板聚集[29]，以及诱导肺实质细胞释放白三烯B4(LTB4)和血栓素B2(TXB2)[30]，继而募集中性粒细胞至感染部位，进一步引起炎性细胞浸润及组织损伤。

3 Lkt与Mh疫苗

由于Mh 的严重危害性，其疫苗研发早在上世纪70年代即已经展开。早期研制的灭活疫苗，虽然能够引起机体产生相应抗体，并具有一定的保护性，但由于缺少Lkt成分，免疫后宿主不具有抗白细胞毒素效应。在某些情况下，该疫苗不仅起不到好的保护效果，反而还可能因为IgG 抗体的调理作用而促进巨噬细胞与Mh 的结合，进而加剧Lkt 引起的细胞毒性，起到促进Mh 感染的作用，而活疫苗因能够持续表达Lkt，可诱导宿主产生中和抗体，从而起到较好的保护性[31]。尽管Lkt 在疫苗保护性中起了重要作用，但Conlon 等的研究却显示，单独采用重组Lkt免疫牛后却并不能抵抗Mh 的攻毒，而该重组Lkt 却能够增强Mh 培养上清对牛的免疫保护性，表明基于Lkt 的免疫保护还需要其他抗原成分的参与[32]。这一发现也为后来将Lkt 作为疫苗研制的主要成分奠定了基础，如目前国外使用的One Shot (由菌影和类毒素构成)、Presponse SQ (由类毒素构成)、Nuplura PH (由外膜蛋白提取物和重组Lkt构成)等疫苗(数据来源：Drugs.com)。后来有研究显示Mh外膜蛋白PlpE 能够增强现有疫苗的保护效果，并且将PlpE 与LktA 融合表达后免疫小鼠能够对其起到良好的保护效果[33]。Batra 等尝试将lktA-plpE 融合基因克隆到牛疱疹病毒载体后免疫大角羊，结果虽然能够检测到抗Lkt 和PlpE 的抗体，但可能由于PlpE 抗体水平较低而导致对免疫动物最终几乎无保护作用[34]。

Mh 疫苗的保护效果在很大程度上取决于其Lkt 的含量，由此Tucci 等还提出用抗Lkt 的抗体来定量测定疫苗中的Lkt 含量，以建立商业化疫苗的验收标准[35]。当前工业化生产的Lkt 产量较低，虽然将重组Lkt 直接添加到疫苗中能够增强疫苗的免疫效果，但这也相应增加了生产成本。而Lkt 产量问题又与菌株的差异、培养基成分、培养条件等诸多因素有关，直到现在，仍然没有一个最优化的条件来最大化Lkt 的产量，而且也缺乏对这方面的研究[3]。

4 小结与展望

Lkt 不论作为毒力因子参与Mh 的感染和致病，还是作为疫苗的主要成分发挥其免疫保护作用，均具有不可替代的作用。由于Lkt 靶细胞的特异性，其并不直接参与宿主组织损伤的形成，而是调动宿主免疫系统，引起过度的免疫反应，在这一过程中，中性粒细胞发挥了主要作用。单独的重组Lkt 不能产生免疫保护效果，意味着其在Mh致病机制中的作用仍有待进一步探究。而NETs 和METs作为一种新发现的非特异性免疫方式，尽管目前已经有很多研究，但Lkt、Mh 诱导其形成的机制，其在牛羊肺炎中的作用，以及Mh 是否对其具有抵抗、逃避的作用均还有待探究，这方面的研究也有助于进一步揭示NETs 和METs 的形成机制以及Mh 的致病机制。另外，考虑到lktA的多样性，还可以将其作为追踪靶标整合入不同血清型的Mh 中进行该疾病流行病学的调查溯源，为疾病防控提供依据。

疫苗接种是预防Mh 病的重要措施。研究显示，在牛群或羊群产生应激反应(运输、换舍等)的前几周对其接种疫苗，能够起到较好的预防Mh 病的效果[36]。这一举措在国外已有较为广泛的应用，但在国内尚未见有Mh 疫苗的报道。这可能是由于国内Mh 病流行情况不如国外严重而没有得到重视所致，但不排除国内将来有Mh 病暴发的风险。对于Mh 疫苗的研究，从细菌本身的角度来讲，一方面可以优化Mh 培养方法，以提高Lkt 的产量；另一方面，也可以通过筛选其他类似于PlpE 的蛋白，以增强基于Lkt 疫苗的免疫效果。本研究室目前正在从事这一方面的研究，通过对具有免疫反应的Mh 培养上清中的蛋白进行质谱分析，拟从中筛选出具有免疫保护或能够激发Lkt保护性的新型保护性抗原，但到目前还尚未筛选到，而对于该类蛋白的筛选也有助于进一步了解Mh 的致病机制。从宿主角度来讲，利用特定病毒载体或其它已知抗原诱导来提高白细胞表面β2 整合素的表达量，从而提高免疫后Lkt 与白细胞的结合量，进而增强疫苗的免疫效果，也是一种较好的疫苗研制方向。由于Lkt 是与反刍动物白细胞表面CD18 分子的信号肽区域相结合而发挥作用的，因此Shanthalingam 等提出构建无CD18 分子信号肽的基因工程牛，也许能够对Mh 的感染产生良好的抵抗性[37]，但缺少信号肽的CD18 分子是否会对机体其他功能产生影响还有待进一步研究。