10种药物对结肠小袋纤毛虫抑杀效果研究

孙晨阳，闫文朝，何 凯，王天奇

(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471023)

结肠小袋纤毛虫病是毛口亚纲(Trichostomatia)、前庭目(Vestibuliferida)、小袋科(Balantidiidae)、小袋属(Balantioides)的结肠小袋纤毛虫(Balantioides coli)，简称小袋虫寄生于猪、人和非人灵长类等50 多种宿主的盲肠和结肠所引起的一种人兽共患寄生虫病。小袋虫是一种土源性寄生虫，呈世界性分布[1-3]。猪的感染较普遍，感染率达20 %～100 %，主要引起断奶仔猪腹泻，小袋虫性腹泻会加重断奶仔猪的死亡率[1,4]。人感染主要是通过吞食被包囊污染的食物或饮水，表现腹痛、腹泻、结肠溃疡和穿孔等症状[1]，还可引起人泌尿生殖道、肺和肝脏等肠道外感染[1,5]。猪是小袋虫最重要的天然宿主，人感染病例中，多数病人有与家猪、野猪或猪粪便有接触史[1]。

目前小袋虫病主要依靠硝基咪唑类药物来控制，最常用的是甲硝唑，其它药物对小袋虫病的疗效报道很少[1,6]。而甲硝唑也是治疗人和动物体内厌氧菌、阿米巴虫、滴虫和贾第虫等病原的常用药物[6-7]，临床上已经报道贾第虫、阿米巴虫和芽囊原虫对甲硝唑等硝基咪唑类药物表现耐药性[8]。在甲硝唑治疗猪和灵长类动物的小袋虫病例中，发现存在反复发作和疗效不明显的情况[6,8]。另外，甲硝唑具有致癌、致畸等毒副作用，相关法规规定禁止或限制使用此类物质作为动物食品的饲料添加剂[9]。因此，本研究选择了阿奇霉素、两性霉素、巴龙霉素、青蒿素和茴香霉素等10 种广谱的抗细菌、真菌和原虫药物，通过体外药物急性毒性试验筛选有效的抗小袋虫药物，为临床上用药物控制动物和人小袋虫病提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物与虫株 替硝唑葡萄糖注射液(批号为国药准字H10960084)购自广东彼迪药业有限责任公司；青蒿素(Lot No.331D021)、盐酸四环素(Cat No.T8180)和两性霉素(Lot No.319A0544)均购自北京索莱宝科技有限公司；阿奇霉素(批号为国药准字H20063284)购自浙江亚太药业股份有限公司；妥曲珠利(批号为兽药字CN28776） 购自拜耳(四川)动物保健公司；巴龙霉素(Lot No.H0522A)购自大连美仑生物技术有限公司；茴香霉素(Cat No.A102397)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸庆大霉素注射液(批号为国药准字H41020318)购自河南润弘制药股份有限公司；氢溴酸常山酮(CAS:55837-20-2)购自武汉大华伟业医药化工有限公司。

本研究所用虫株来自洛阳市某养猪场，取自然感染仔猪的腹泻粪便，镜检可见大量的、运动活跃的小袋虫滋养体。培养前首先用适量生理盐水悬浮阳性粪样，用60 目和100 目筛网过滤除去体积比较大的杂质，滤液静置45 s，吸取悬浮液中间层含大量滋养体的液体，除去比重较大的杂质和上层杂菌，然后用改进型DMEM 培养基[10]进行驯化培养，一般换液传代2～3 次，滋养体纯度和数量即可达到药物筛选试验要求。

1.2 主要试剂 青霉素(批号为国药准字H180101)、链霉素(批号为国药准字H01171003)、可溶性淀粉购自北京市海淀区微生物培养基制品厂；特级马血清(用前56 ℃灭活30 min)购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 小袋虫滋养体体外扩增培养 利用改进型DMEM 培养基进行体外培养[10]，向每个高压灭菌的10 mL 西林瓶内加入2 mL DMEM 培养液和青霉素、链霉素1×104IU/mL、淀粉10 mg、特级马血清0.5 mL和含有大量结肠小袋纤毛虫滋养体粪便样品约0.5 mL，混匀后编号，在28 ℃恒温培养24 h 后，镜检可观察到大量的、运动活跃的小袋虫滋养体即可进行药物筛选试验。

1.4 小袋虫滋养体抑杀药物的筛选 选取替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、四环素、青蒿素、常山酮、两性霉素、巴龙霉素、庆大霉素和茴香霉素共10 种不同类型药物作为抗小袋虫的体外试验用药。除青蒿素不溶于水外，其它9 种药物均可用灭菌蒸馏水配制储存液。因此，采用二甲基亚砜溶解青蒿素制备储存液。

因大部分药物对小袋虫抑杀效果没有文献报道，本研究参考这些药物对细菌、真菌或原虫的治疗剂量，每一种药通过设置高、中、低3 个剂量组和不加药对照组(表1)来确定药物是否有效[11-13]。在改进型DMEM 培养基中加入数量相等的小袋虫滋养体(2 000 个/ 瓶)和高、中、低剂量的药物，混合作用6 h、12 h 和24 h 后，分别制片在显微镜下观察滋养体运动活性和数量的变化，滋养体计数方法参考本实验室已建立的方法[10]。另外，为了排除二甲基亚砜对滋养体的毒性作用，在筛选青蒿素的抑杀效果试验中，额外设置加二甲基亚砜组。每个组设置3 个重复。

加入药物后6 h、12 h 和24 h 观察，将小西林瓶内液体充分混匀，吸取10 μL 滴于载玻片上，于4 倍物镜下观察滋养体运动活性并计数。若连续观察两张玻片未见滋养体，则记录虫体数为0，第一次观察未见滋养体的培养瓶需在加入药物后12 h 和24 h 时再观察，以证实判定。通过观察不同浓度药物中滋养体的运动活性、数量变化和药物作用快慢等指标来判定药物对小袋虫的抑杀效果，加入药物后不同时间点滋养体运动越缓慢，数量减少越明显，说明药物的抑杀效果越强[14-15]。

1.5 不同梯度浓度药物的急性毒性试验 经1.4 初步筛选出对小袋虫滋养体有抑杀效果的药物，进一步对其进行浓度梯度的药物急性毒性试验[14-15]，观察其半数致死浓度(LC50)和最小杀虫浓度(MIC)。每一种有抑杀效果的药物设置6～10 个不同浓度(表1)和1 个不加药对照组，各实验组及对照组加入的虫体数量一致(2 000 个/ 瓶)，加盖后28 ℃恒温培养，分别于6 h、12 h 和24 h 镜检观察和计数。

表1 筛选抗小袋虫药物的试验设计Table 1 Experimental design for screening drugs against B.coli

1.5.1 药物抑杀小袋虫相对死亡率的计算 以不加药对照组的平均虫体数目为A，以该药物各个浓度梯度的平均活虫体数目为B，计算(A-B)/A 的数值，并转换为百分数，即不同浓度时的虫体相对死亡百分率。对照死亡机率单位转换表，将不同浓度下的相对死亡百分率转换成死亡机率单位[15]。

1.5.2 LC50及其95 %置信限的计算 利用Excel 软件，以浓度对数为横轴，以死亡机率单位为纵轴，作X-Y 散点图，添加趋势线并获得该线的回归方程及R2。将各个浓度对数代入回归线方程计算出期望死亡机率，根据死亡百分率与机率单位值的转换表，将期望死亡机率转换成期望死亡率(p)。对照组虫体数目(n)与各个浓度虫体数目的差值为死亡虫体数(r)。将所有不同浓度梯度的(r-np)2/np (1-p)相加得到X2，如果＞X2时所作回归线完全符合要求，如果X2≥，则应重新做试验，获得新的回归线，并继续进行X2检验。经X2检验回归线符合要求后，利用回归方程求出死亡机率单位为5 (死亡率为50 %)时的药物浓度对数logLC50，查反对数表就可获得LC50[15]。

2 结 果

2.1 10 种药物对小袋虫滋养体的抑杀效果 在体外药物与滋养体作用不同时间点，通过观察滋养体的运动活性和数量变化来评定药物对小袋虫的抑杀效果。结果显示，10 种药物中，有6 种药物是有效的，分别是替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四环素。替硝唑(8 μg/mL)和阿奇霉素(5 mg/mL)在低浓度下作用6 h 就可以看到明显杀虫效果，镜检观察到滋养体运动明显缓慢且部分滋养体表膜塌陷或破裂，内容物崩解释放，伸缩泡体积增大等异常现象(图1)，虫体数量减少明显，与对照组差异显著(p＜0.01)；妥曲珠利(1 mg/mL)、常山个酮(1 mg/mL)和青蒿素(5 mg/mL)在中浓度作用6 h～12 h 可以看到明显杀虫效果，其中青蒿素试验中添加二甲基亚砜组的滋养体活性和数量与不加药对照组无明显差别(p＞0.05)，表明二甲基亚砜对小袋虫滋养体无明显毒性，用其溶解青蒿素不影响青蒿素对滋养体的抑杀效果；四环素在中、高浓度下作用12 h 以上才能观察到滋养体数量和活性明显下降(p＜0.05)。而茴香霉素、两性霉素、巴龙霉素和庆大霉素即使在高浓度作用下小袋虫滋养体活性和数量与对照组无显著差异(p＞0.05)，表明这4 种药物对小袋虫滋养体无抑杀效果。

2.2 有效药物的LC50和MIC 测定结果 根据不同浓度梯度药物的急性毒性试验的方法，进行药物LC50和MIC 的测定，结果进一步证实替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四环素能明显抑制小袋虫滋养体的生长，作用6 h～24 h 滋养体数量明显减少，运动活性明显降低。6 种药物在作用6 h、12 h 和24 h 的 MIC 具体见表2。结果表明替硝唑和阿奇霉素抑杀小袋虫的效果最明显，四环素抑杀效果比较缓慢。

由于部分药物与虫体作用12 h 后，虫体已全部死亡，因此本研究选择药物与虫体作用6 h 这个时间点来绘制回归直线和回归方程，计算其LC50(LC50,6h)。首先利用死亡机率单位法获得回归方程，经X2检验回归方程符合要求，然后计算出替硝唑、阿奇霉素、妥曲珠利、常山酮、青蒿素和四环素这6 种药物的 LC50,6h，分别是 5.061 μg/mL、1.065 mg/mL、0.598 mg/mL、1.527 mg/mL、1.308 mg/mL、0.557 mg/mL(表2～表5，图2～图4)。替硝唑的 LC50,6h最小，常山酮和青蒿素的LC50,6h相对较高，阿奇霉素的LC50,6h虽然不低，但是虫体活性明显下降。表明药物对小袋虫的LC50,6h与其杀虫效力不呈正相关，可能与药物作用机理有关。

图1 替硝唑和阿奇霉素作用6 h～12 h 对小袋虫滋养体的影响Fig.1 Efficacy of Tinidazole and Azithromycin against B.coli trophozoites 6 to 12 hours after incubation

表2 替硝唑作用6 h 对小袋虫急性毒性试验结果Table 2 Acute toxicity test results of Tinidazole against B.coli for 6 h

图2 替硝唑作用6 h 对小袋虫急性毒性反应的浓度对数-死亡机率单位曲线Fig.2 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Tinidazole for 6 h

表3 阿奇霉素作用6 h 对小袋虫急性毒性试验结果Table 3 Acute toxicity test results of Azithromycin on B.coli for 6 h

图3 阿奇霉素作用6 h 对小袋虫对急性毒性反应的浓度对数-死亡机率单位曲线Fig.3 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Azithromycin for 6 h

3 讨 论

由于寄生于猪、人、非人灵长类等宿主的小袋虫在滋养体形态特征、分子遗传进化关系上与寄生于蛙类、较早命名的Balantidium entozoon(Ehrenberg，1838)差异太大，根据国际动物系统命名法，最近有多位学者建议小袋虫应列为另外一个属BalantioidesAlexeieff，1931。因此，小袋虫的拉丁名称由原来的Balantidium coli改为Balantioides coli(Malmstein，1857)[2-3]。小袋虫能感染50 多种宿主，其中对猪和人具有明显的致病性[1]。筛选出多种有效的抗小袋虫药物，将为临床上控制猪和人的小袋虫病提供更多有效手段。

表4 青蒿素作用6 h 对小袋虫急性毒性试验结果Table 4 Acute toxicity of Artemisinin on B.coli for 6 h

图4 青蒿素作用6 h 对小袋虫急性毒性反应的浓度对数-死亡几率单位曲线Fig.4 Logarithmic of concentration-death odds unit curve of acute toxic response of B.coli to Artemisinin for 6 h

表5 6 种有效药物对小袋虫滋养体的抑杀效果Table 5 Inhibitory efficacy of six effective drugs against B.coli

本研究首次检测了阿奇霉素、巴龙霉素、茴香霉素、两性霉素B、妥曲珠利、庆大霉素对小袋虫滋养体体外抑杀效果。阿奇霉素属于大环内酯类抗生素，对衣原体、嗜血杆菌、淋球菌、链球菌和隐孢子虫等多种病原微生物和原虫有明显的治疗效果[11]。本研究发现，新鲜配制的阿奇霉素对小袋虫滋养体具有明显而快速的抑杀效果，但是配制的储存液于4 ℃放置超过24 h，其疗效明显下降，其原因有待进一步研究。巴龙霉素是氨基糖甙类广谱抗生素，对革兰氏阴性菌、抗酸杆菌、阿米巴原虫、隐孢子虫和绦虫具有抑杀作用[12]。在本研究中，巴龙霉素对小袋虫没有明显抑杀效果。茴香霉素是一种链霉菌提取物，具有抗真菌、阿米巴原虫和贾第虫以及抑制T 细胞活化等功效；两性霉素B 是多烯类抗真菌药物[13]；庆大霉素为氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌具有很好疗效。本试验发现，这3 种药物对小袋虫均没有治疗效果。妥曲珠利是一种高效的三嗪酮类抗球虫药物，其对小袋虫滋养体具有较明显的抑制作用。另外，本研究发现替硝唑和四环素对小袋虫具有抑杀效果，特别是替硝唑对小袋虫的抑杀速度和效果最明显，而四环素的抑杀作用比较缓慢，与相关研究结果一致[1,14]。

除了西药外，寻找中药或中药提取物作为治疗细菌、真菌和寄生虫病的替代药物，成为国际兽医学和医学领域的研究焦点。张梦等发现常山和青蒿的熬制液对小袋虫滋养体具有较明显的抑制作用，由于中草药熬制液中成分较多，发挥疗效的是不是青蒿素或常山酮，还不能证明[15]。本研究用青蒿素和常山酮的单一成分检测了对小袋虫滋养体的作用效果，发现常山酮和青蒿素能明显抑杀小袋虫滋养体。说明常山酮和青蒿素可以作为治疗小袋虫病的候选药物。

在建立小袋虫滋养体体外培养方法的基础上[10]，本研究查阅阿奇霉素等10 种药物的用药剂量和水生生物毒性试验方法[11-14]，先按照2～10 倍药物常规剂量预设高、中、低3 个剂量，来检测每种药物对小袋虫滋养体是否有抑杀效果，如果有效，进一步进行药物不同浓度急性毒性试验来筛选该种药物的MIC 和LC50，最后综合评价药物对小袋虫滋养体的抑杀效果。利用该方法从10 种药物中筛选出阿奇霉素、妥曲珠利、四环素、青蒿素、常山酮和替硝唑6 种药物对小袋虫滋养体具有抑杀效果，为进一步临床治疗试验提供重要参考。