非酒精性脂肪性肝病患者血清TLR4、IL-10、IL-22与肠道菌群的相关性

张丹琴 杨帆 李胜保

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种慢性肝脏疾病，主要病理特征是弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变[1]。NAFLD患者存在肠道菌群失调，直接影响脂肪的储存和代谢。Toll样受体4(TLR4)是Toll样受体(TLR)家族成员之一，其可通过相关信号通路介导炎性反应[2]。白介素-22(IL-22)是白介素-10(IL-10)家族成员，均是促炎症因子，参与炎性反应和组织修复[3]。为了探讨NAFLD患者肠道菌群变化与TLR4、IL-10、IL-22的相关性，本文选取我院收治的126例NAFLD患者进行研究。现将结果报道如下。

资料与方法

一、研究对象

选取2016年6月至2018年8月期间我院收治的126例NAFLD患者进行研究。所有患者均确诊为NAFLD。纳入标准：均符合2010年NAFLD诊疗指南[4]；排除标准：自身免疫性肝病和病毒性肝炎等引起的脂肪肝；合并严重脑、心、肾等功能障碍；恶性肿瘤；血液系统疾病；免疫系统疾病；近期应用过抗生素、酸奶、微生态调节剂等影响肠道菌群的制剂。

二、一般资料

126例患者中男性68例，女性58例，年龄23～65岁，平均(48.35±6.24)岁，其中单纯性非酒精性脂肪肝(NAFL)49例，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)54例，肝硬化23例。对照组为同期进行体检的健康人90例，男性47例，女性43例，年龄24～64岁，平均(48.02±6.09)岁。两组一般资料具有可比性(P>0.05)。

三、方法

(一)肠道菌群及肠道定植抗力 采集两组研究对象的新鲜粪便1.5 g，放置于密闭无菌盒中，0.5 h内送检。称取0.5 g样本放入有4.5 mL无菌生理盐水中混合均匀，按照10倍连续稀释法分别稀释至10～9，分别取10～9、10～7、10～5、10～3、10～1稀释液50 μL依次接种在选择性培养基上。双歧杆菌用BS血琼脂平板，乳酸杆菌用MRSA营养琼脂平板，肠杆菌用中国兰琼脂平板，肠球菌用羊血平板。需氧菌双歧杆菌、乳酸杆菌放置于35℃孵箱中培养24 h，厌氧菌肠杆菌、肠球菌采用抽气换气培养法培养48 h。采用法国生物梅里埃公司ATB半自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定。B/E值为双歧杆菌和肠杆菌数量的比值，代表肠道定植抗力。

(二)血清TLR4、IL-10、IL-22检测 抽取所有研究对象清晨空腹静脉血4 mL，采用酶联免疫吸附法检测IL-10、IL-17和IL-23。

四、统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。血清TLR4、IL-10、IL-22水平为计量资料，两组间均数比较采用t检验。采用Pearson相关性分析和logistic多元回归分析进行影响因素分析。检验水准α=0.05，当P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、两组肠道菌群含量的比较

与对照组比较，NAFLD组双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值更低(P<0.05)，肠杆菌、肠球菌更高(P<0.05)。见表1。

二、两组血清TLR4、IL-10、IL-22水平的比较

NAFLD组血清TLR4显著高于对照组，IL-10、IL-22低于对照组(P<0.05)。见表2。

三、NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22与肠道菌群的相关性分析

经过Pearson相关性分析，NAFLD患者TLR4与双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值呈负相关(P<0.05)，与肠杆菌、肠球菌呈正相关(P<0.05)；IL-10、IL-22与双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值呈正相关(P<0.05)，与肠杆菌、肠球菌呈正负相关(P<0.05)。见表3。

四、 NAFLD患者肠道菌群的logistic回归分析

以B/E值为自变量，TLR4、IL-10、IL-22为因变量，进行logistic回归分析发现，TLR4、IL-10、IL-22是NAFLD患者B/E值的影响因素。结果见表4。

表1 两组肠道菌群含量比较(lg CFU/g, ±s)

表2 两组血清TLR4、IL-10、IL-22水平比较(±s)

表3 NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22与肠道菌群的相关性分析

表4 NAFLD患者肠道菌群的logistic回归分析

讨 论

有许多研究表明[5]，NAFLD的发生与肠源性内毒素血症有密切关系，而细菌移位、小肠细菌过度生长、肠黏膜通透性异常等均可引起肠源性内毒素血症。在正常人的肠道内，各种菌群保持着动态平衡，维护着肠黏膜屏障和免疫屏障[6]。当肠道菌群失调时，会导致有害菌异常增加，使肠道黏膜屏障受损，大量内毒素进入门静脉，损害肝细胞，同时通过肝脏进入血液形成内源性内毒素血症，引发炎症反应，形成恶性循环[7]。

TLR是一类天然免疫关键受体。作为TLR家族一员，TLR4是革兰氏阴性细菌细胞壁成分LPS的受体，具有诱导炎症、抗病毒、抑制细胞因子产生等作用。TLR4表达于各种肝细胞，当TLR4过度表达时，可诱导肝脏发生免疫应答，引起肝脏慢性炎症反应性疾病[8]。

IL-10是一种重要的免疫调节细胞因子，由Th2细胞和单核-巨噬细胞产生，其可通过抑制单核细胞、巨噬细胞活性，抑制肝纤维化进程[9]。

本研究结果表明，与对照组相比，NAFLD组双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值更低(P<0.05)，肠杆菌、肠球菌更高(P<0.05)。证实NAFLD患者确实存在肠道菌群失调。肠道定植能力是指内源性厌氧菌抑制潜在致病菌在肠道内定植的能力，因此B/E值可以全面评价肠道的菌群变化。本研究还表明，与对照组相比，NAFLD组血清TLR4更高，IL-10、IL-22更低(P<0.05)。说明NAFLD患者体内血清TLR4、IL-10、IL-22水平异常变化。研究表明[10]，NAFLD患者由于肠道菌群失调，肝脏中内毒素(LPS)增多，使得LPS受体TLR4表达上调，肠壁通透性增强，形成肠源性内毒素血症，引发炎症反应，同时还通过MyD88途径激活核因子B，引发强力的炎症反应，最终导致肝脏损伤。研究表明，随着肝损伤程度的加重，IL-10表达逐渐降低，从而参与酒精性肝病发展过程[11]。IL-22是IL-10的同源性细胞因子，可能具有相同的保护肝脏的作用。相关研究表明[12]，经过IL-22处理的ApoE基因敲除小鼠，血脂及肝指数均降低，能减轻小鼠肝脏的炎症程度，提示IL-22能缓解肝脏病变进程，抑制肝纤维化。

经过Pearson相关性分析，NAFLD患者TLR4与双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值呈负相关(P<0.05)，与肠杆菌、肠球菌呈正相关(P<0.05)；IL-10、IL-22与双歧杆菌、乳酸杆菌、B/E值呈正相关(P<0.05)，与肠杆菌、肠球菌呈正负相关(P<0.05)。经logistic回归分析发现，IL-10、IL-17、IL-23是NAFLD患者B/E值的影响因素。分析其可能原因是NAFLD患者肠道菌群紊乱，产生大量内毒素，诱导TLR4过表达，当TLR4过度表达时，可导致肠壁通透性增强，形成肠源性内毒素血症，进而诱导肝脏发生免疫应答，引起肝脏慢性炎性病变；另外，TLR4还可能通过MyD88途径激活NFκB，进而刺激炎性因子的释放，抑制IL-10、IL-22的分泌，放大肝脏炎症反应，由此共同参与NAFLD过程。因此推测，TLR4与IL-10、IL-22可能存在上下游关系，可能是NAFLD发展过程中的一个炎症通路，但还需进一步的研究验证。