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滇南开唇兰化学成分研究

2020-01-12钱丽萍阙慧卿彭华毅陈阿虹郭舜民李援朝

中国民族民间医药 2020年24期
关键词:滇南分子式槲皮素

钱丽萍 阙慧卿 彭华毅 李 唯 陈阿虹 郭舜民 李援朝 林 绥*

1.福建省医学科学研究院 福建省医学测试重点实验室,福建 福州 350001;2.福州海关技术中心(福建省检验检疫技术研究重点实验室),福建 福州 350003;3.中国科学院上海药物研究所,上海 201203

滇南开唇兰AnoectochilusburmannicusRolfe为兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)植物,主要生长在云南南部至西南部,有研究报道[1]滇南开唇兰水提物具有抗炎和胰岛素抵抗作用。前期已报道[2]滇南开唇兰挥发油成分,比较了不同采收期的挥发油成分,成分和含量均有差别。本研究对滇南开唇兰植物全草进行了化学成分的研究,从滇南开唇兰的正丁醇及乙酸乙酯提取部位中分离到13个化合物,根据理化性质、光谱数据及文献数据,经鉴定13个化合物依次为:芦丁(1),山奈酚(2),棕榈酸(3),槲皮素(4),anoectosterol(5),β-D-glucopyranosyl-(3R)-hydroxybutanolide(kinsenoside)(6),anoectochine(7),石杉碱甲(8),ginsenine(9),硬脂酸(10),异鼠李素(11),8-对羟基苄基槲皮素(12),5,4′-二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮(cirsilineol)(13)。1~13化合物均为首次滇南开唇兰植物全草中提取分离到的。

1 仪器与药材

1.1 仪器 APAⅡ自动探针熔点分析仪(德国Schorpp Geratelechik 公司),Avatar-330型红外光谱仪(美国Thermo Electron Wrporation 公司),UV-300型紫外分光光度计(日本岛津公司),Unity-500型核磁共振仪(美国 Varaina 公司),Finnigan MAT-312 型质谱仪(美国 Finnigan 公司),WFH-201B 暗箱式紫外透射仪(上海精科实业有限公司),LC-20A 型岛津半制备高效液相色谱仪(日本岛津公司),RE-2000B型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),HH-2型数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂)。

1.2 材料 实验用药材为种植 6个月的滇南开唇兰AnoectochilusburmannicusRolfe,由福建省华芝韵生物科技有限公司提供,经福建中医药大学(药用植物学/中药鉴定)杨成梓副教授及褚克丹教授鉴定为滇南开唇兰AnoectochilusburmannicusRolfe。实验用高效薄层板、薄层用色谱硅胶G、柱层析硅胶(100-200目,200-300目)均为青岛海洋化工厂产品,其余化学试剂均为市售色谱纯和分析纯。

2 提取与分离

种植6个月的滇南开唇兰全草20 kg用75%乙醇浸泡24 h,提取2次,过滤提取液,减压浓缩得粗浸膏1961 g,用适量水混悬,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液,分别减压浓缩得各部位浸膏。乙酸乙酯部位浸膏730 g,正丁醇部位浸膏690 g,取正丁醇及乙酸乙酯部位浸膏分别经硅胶柱层析反复色谱分离,用不同比例的石油醚:乙酸乙酯和三氯甲烷:甲醇洗脱,得到化合物1(1995 mg),化合物2(189 mg),化合物3(156 mg),化合物4(159 mg),化合物5(95 mg),化合物6(89 mg),化合物7(81 mg),化合物8(105 mg),化合物9(83 mg),化合物10(235 mg),化合物11(155 mg),化合物12(129 mg),化合物13(103 mg)。

3 结构鉴定

化合物1,淡黄色粉末,mp 184~187 ℃,紫外灯下呈亮浅蓝色荧光,HCl-Mg 粉反应阳性,Molish 反应阳性,FeCl3反应阳性,EI-MS m/z:610 [M]+,分子式C27H30O16。UVλmax nm(MeOH):363,251,210。IRυmax cm-1(KBr):3430(OH),1655(C=O),1607,1509,1456(苯环),1365,1300,1205。1HNMR(DMSO)δ:6.18(1H,d,J=1.8Hz,H-6),6.39(1H,d,J=1.8Hz,H-8),7.56(2H,m,H-2′,6′),6.86(1H,d,J=8.8Hz,H-5′),5.36(1H,d,J=7.38Hz,H-1″),5.08(1H,d,J=6.0Hz,H-1‴),1.01( 3H,d,J=6.4Hz,CH3-6‴),12.61(1H,s,OH-5),10.87(1H,s,OH-7),9.69(1H,s,OH-4′),9.19(1H,s,OH-3′),糖部分其它质子δ:3.05-5.28。13C-NMR(DMSO-d6)δ:157.1(C-2),133.3(C-3),177.3(C-4),161.7(C-5),99.1(C-6),163.8(C-7),93.9(C-8),157.2(C-9),105.3(C-10),121.5(C-1′),115.5(C-2′),145.3(C-3′),149.1(C-4′),116.7(C-5′),122.1(C-6′),101.7(C-1″),75.2(C-2″),77.1(C-3″),70.5(C-4″),75.9(C-5″),67.5(C-6″),101.1(C-1‴),70.9(C-2‴),71.1(C-3‴),72.3(C-4‴),68.6(C-5‴),18.1(C-6‴)。与芦丁标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,根据理化性质及以上检测所得数据与文献[3-5]报道的芦丁一致,确认化合物1为芦丁。

化合物2,黄色针状结晶,mp263~265 ℃,HCl-Mg粉和AlCl3反应呈阳性,EI-MS m/z:286 [M]+,分子式:C15H10O6。UVλmax nm(MeOH):255,369。IRυmax cm-1(KBr):3180,1675,1605,1580。1HNMR(acetone-d6)δ:6.23(1H,d,H-6),6.53(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.97(2H,d,J=9.2Hz,H-3′,5′),8.11(2H,d,J=9.2Hz,H-2′,6′),8.03,9.11,9.75,12.18(-OH)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:146.9(C-2),136.5(C-3),176.3(C-4),157.6(C-5),99.1(C-6),164.9(C-7),94.5(C-8),162.1(C-9),103.9(C-10),123.3(C-1′),116.3(C-3′ 和C-5′),130.3(C-2′和C-6′),159.9(C-4′)。与山奈酚标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,根据理化性质及以上检测所得数据,与文献[6-8]报道的山奈酚(kaempferol)一致,确认化合物2为山奈酚。

化合物3,为白色颗粒状结晶(石油醚-乙酸乙酯),mp 61~63 ℃,EI-MS m/z:256 [M]+。分子式:C16H32O2。IRυmax cm-1(KBr):3500(宽峰,COOH中的OH),1705(C=O)。1HNMR(CDCl3)δ:2.36(2H,t,J=7.6Hz,O=C-CH2),1.64(2H,m,CH2),1.26(24H,brs,-CH2-×12),0.89(3H,t,J=6.8Hz,CH3)。13C-NMR(CDCl3)δ:180.72(C-1),34.03(C-2),31.91(C-3),29.78(C-4),29.71(C-5),29.65(C-6),29.59(C-7),29.51(C-8),29.48(C-9),29.42(C-10),29.35(C-11),29.19(C-12),29.03(C-13),24,65(C-14),22.68(C-15),14.11(C-16)。根据理化性质及在MS中一系列失去CH2的碎片峰如:143,129,115,101,87,73,69,57,与棕榈酸标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,跟据以上检测所得数据,与文献[9-12]报道的棕榈酸(palmitic acid)一致,确认化合物3为棕榈酸。

化合物4,黄色针状结晶(甲醇),mp 313~315 ℃,HCl-Mg粉反应呈阳性,Molish 反应阴性性,示为黄酮类化合物,EI-MS m/z:302 [M]+,273,153,137,分子式:C15H10O7。UVλmax nm(MeOH):208,256,369。IRυmax cm-1(KBr)::3435(OH),1645(C=O),1610,1515,1430(Ar)。1HNMR(DMSO)δ:6.19(1H,d,J=2.0Hz,H-6), 6.38(1H,d,J=2.2Hz,H-8),6.89(1H,d,J=8.6Hz,H-5′),7.57(1H,dd,J=8.6Hz,J=2.2Hz,H-6′),7.71(1H,d,J=2.2Hz,H-2′),示有A环5,7取代,B 环为ABX 系统。13C-NMR(DMSO-d6)δ:147.3(C-2),135.9(C-3),175.9(C-4),160.1(C-5),98.5(C-6),163.7(C-7),93.8(C-8),158.3(C-9),103.3(C-10),122.5(C-1′),115.7(C-2′),145.1(C-3′),147.6(C-4′),115.5(C-5′),120.7(C-6′)。与槲皮素标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,根据理化性质及以上检测所得数据与文献[13-15]报道的槲皮素(quercetin)一致,确认化合物4为槲皮素。

化合物5,针状结晶,mp 139~141 ℃(CHCL3-MeOH),EI-MS m/z:424 [M]+,分子式:C30H48O。UVλmax nm(MeOH): 253,371。IRυmax cm-1(KBr): 3430(OH),2920(CH),1460(C=C)。1HNMR(CDCl3)δ:1.09(1H,m,H-1),1.87(1H,m,H-1),1.51(1H,m,H-2),1.85(1H,m,H-2),3.53(1H,m,H-3),2.23(1H,m,H-4),2.29(1H,m,H-4),5.36(1H,brd,J=5.4Hz,H-6),1.53(1H,m,H-7),1.99(1H,m,H-7),1.47(1H,m,H-8),0.95(1H,m,H-9),1.49(2H,m,H-11),1.18(1H,m,H-12),2.01(1H,m,H-12),1.01(1H,m,H-14),1.53(2H,m,H-15),1.26(1H,m,H-16),2.21(1H,m,H-16),1.16(1H,brd,J=4.0Hz,H-17),0.69(3H,s,H-18),1.03(3H,s,H-19),2.05(1H,m,H-20),1.00(3H,d,J=6.2Hz,H-21),5.23(1H,dd,J=15.4Hz,J=8.0Hz,H-22),5.15(1H,dd,J=15.4Hz,J=7.6Hz,H-23),2.42(1H,ddd,J=7.0Hz,J=7.0Hz,J=7.0Hz,H-24),1.41(1H,m,H-241),1.51(1H,m,H-241),0.85(3H,t,J=7.4Hz,H-242),1.98(2H,m,H-26),1.03(3H,t,J=7.6Hz,H-261),4.73(2H,dd,J=1.4Hz,J=1.2Hz,H-27)。13C-NMR(CDCl3)δ:37.3(C-1),31.8(C-2),71.9(C-3),42.3(C-4),140.9(C-5),121.9(C-6),31.9(C-7),32.1(C-8),50.3(C-9),36.7(C-10),21.3(C-11),39.9(C-12),42.3(C-13),57.1(C-14),24.3(C-15),28.9(C-16),56.1(C-17),12.3(C-18),19.5(C-19),40.3(C-20),20.9(C-21),137.3(C-22),130.7(C-23),51.3(C-24),26.3(C-241),12.3(C-242),154.9(C-25),27.1(C-26),12.5(C-261),107.1(C-27)。根据理化性质及以上检测所得数据与文献[16]报道的[anoectosterol(26-Methylstigmasta-5,22,25,(27)-trien-3β-ol)]一致,确认化合物5为anoectosterol。

化合物6,油状物,EI-MS m/z:264 [M]+,分子式:C10H16O8。UVλmax nm(MeOH):218,258,370。IRυmax cm-1(KBr):3400(OH),2970(CH),1775(C=O)。1HNMR(pyridine-d5)δ:2.88(1H,dd,J=17.6Hz,J=2.8Hz,H-2),2.93(1H,dd,J=17.6Hz,J=5.2Hz,H-2),4.89(1H,dddd,J=5.2Hz,J=4.6Hz,J=2.8Hz,J=1.6Hz,H-3),4.43(1H,dd,J=10.4Hz,J=4.6Hz,H-4),4.71(1H,dd,J=10.4Hz,J=1.6Hz,H-4),4.91(1H,d,J=8.0Hz,G-H-1),3.99(1H,t,J=8.0Hz,G-H-2),4.25(1H,m,G-H-3),4.23(1H,m,G-H-4),3.97(1H,m,G-H-5),4.37(1H,dd,J=11.8Hz,J=5.8Hz,G-H-6),4.56(1H,dd,J=11.8Hz,J=2.4Hz,G-H-6)。13CNMR(pyridine-d5)δ:176.3(C-1),35.8(C-2),75.6(C-3),74.9(C-4),104.5(G-C-1),75.1(G-C-2),78.7(G-C-3),71.5(G-C-4),78.3(G-C-5),62.9(G-C-6)。根据理化性质及以上检测所得数据与文献[17-18]报道的kinsenoside(β-D-glucopyranosyl-(3R)-hydroxybutanolide)一致,确认化合物6为kinsenoside。

化合物7,黄色固体,碘化铋钾反应呈阳性,推测为生物碱类化合物,EI-MS m/z:216 [M]+。分子式:C12H12N2O2。UVλmax nm(MeOH):220,270,277,280。IRυmax cm-1(KBr):3350(NH),3085,3020(-CH),2925,2850,2795(C-H),1790(C=O),1635(C=C),1615,1550,1480,1450。1HNMR(DMSO-d6)δ:7.44(1H,d,J=8.0Hz,H-4),6.99(1H,dd,J=7.0Hz,J=8.0Hz,H-5),7.07(1H,dd,J=7.0Hz,J=8.0Hz,H-6),7.33(1H,d,J=8.0Hz,H-7),4.19(1H,d,J=16.0Hz,H-8),4.23(1H,d,J=16.0Hz,H-8),3.61(1H,dd,J=5.0Hz,J=10.6,H-11),2.81(1H,dd,J=10.6Hz,J=16.0Hz,H-12),3.13(1H,dd,J=5.0Hz,J=16.0Hz,H-12),10.9(1H,s,N1-H),8.78(1H,brs,OH),6.05(1H,s,N9-H)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:126.3(C-2),106.7(C-3),127.8(C-3a),117.9(C-4),118.7(C-5),121.3(C-6),111.1(C-7),136.3(C-7a),40.3(C-8),169.3(C-10),56.8(C-11),23.0(C-12)。根据理化性质及以上检测所得数据与文献[19]报道的anocetochine一致,确认化合物7为anocetochine。

化合物8,结晶颗粒,mp229~231 ℃(丙酮),碘化铋钾反应呈阳性,推测为生物碱类化合物,EI-MS(m/z):242 [M]+,分子式:C15H18N2O。UVλmax nm(MeOH):230,313。IRυmax cm-1(KBr):3485,3185,1650,1550。1HNMR(CDCl3)δ:6.39(1H,d,J=9.0Hz,H-2),7.83( 1H,d,J=9.0Hz,H-3),2.77(2H,dd,J=16.0Hz,J=3.0Hz,H-6),3.57(1H,m,H-7),5.39(1H,d,J=5.0Hz,H-8),1.62(3H,d,J=7.0Hz,H-10),5.47(1H,q,J=7.0Hz,H-11),2.11(2H,s,H-14),1.47(3H,s,H-16),13.20(1H,br.s,N-H)。13C-NMR(CDCl3)δ:165.5(C-1),117.1(C-2),140.3(C-3),133.0(C-4),142.6(C-5),35.3(C-6),33.2(C-7),124.5(C-8)12.7(C-10),111.3(C-11),143.5(C-12),54.8(C-13),49.7(C-14),134.6(C-15)23.1(C-16)。根据理化性质及以上检测所得数据与文献[20-22]报道的石杉碱甲一致,确认化合物8为石杉碱甲。

化合物9,白色粉末,碘化铋钾反应呈阳性,推测为生物碱类化合物,EI-MS m/z:230 [M]+,分子式:C13H14N2O2。UVλmax nm(MeOH):221,278,289。IRυmax cm-1(KBr):3370(NH),3300(OH),2985,1650(C=O)。1HNMR(DMSO-d6)δ:4.53(1H,d,J=6.6Hz,H-3),3.62(1H,dd,J=4.8Hz,J=11.8Hz,H-6),3.17(1H,ddd,J=2.6Hz,J=4.8Hz,J=15.2Hz,H-7),2.78(1H,ddd,J=2.6Hz,J=11.8Hz,J=15.2Hz,H-7),7.46(1H,d,J=8.0Hz,H-10),7.01(1H,ddd,J=2.0Hz,J=7.6Hz,J=8.0Hz,H-11),7.09(1H,ddd,J=2.0Hz,J=7.6Hz,J=8.0Hz,H-12),7.35(1H,d,J=8.0Hz,H-13),1.63(3H,d,J=6.6Hz,H-15),11.11(1H,s,N-H),8.77(1H,s,O-H)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:133.1(C-2),49.2(C-3),169.7(C-5),58.1(C-6),23.3(C-7),107.3(C-8),126.5(C-9),118.2(C-10),118.9(C-11),121.5(C-12),111.5(C-13),136.7(C-14),17.3(C-15)。根据理化性质及以上检测所得数据与文献[23]报道的ginsenine一致,确认化合物9为ginsenine,是首次从开唇兰科植物中分离得到的。

化合物10,白色固体颗粒,mp 71~73 ℃,EI-MS m/z:284 [M]+,分子式:C18H36O2。IRυmax cm-1(KBr):3500(宽峰,COOH中的OH),1705(C=O)。1HNMR(CDCl3)δ:2.33(2H,t,J=7.6Hz,H-2),1.63(2H,m,H-3),1.28(多个H,m,H-4-17),0.88(3H,t,J=6.6Hz,H-18)。13C-NMR(CDCl3)δ:179.6(C-1),33.9(C-2),31.9(C-3),29.9-29(C-4-14),28.8(C-15),24.7(C-16),22.7(C-17),14.3(C-18)。与硬脂酸标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,跟据以上检测所得数据,与文献[17,24]报道的硬脂酸(stearic acid)一致,确认化合物10为硬脂酸。

化合物11,黄色结晶性粉末,mp 283~285 ℃(MeOH),HCl-Mg 反应呈阳性,Molish 反应呈阴性,EI-MS m/z:316[M]+,分子式:C16H12O7。UVλmax nm(MeOH):255,265,368。IRυmax cm-1(KBr)::3450(OH),1650(C=O),1610,1515,1430(Ar)。1HNMR(DMSO-d6)δ:7.75(1H,s,H-2′),7.69(1H,d,J=8.6Hz,H-6′),6.95(1H,d,J=8.6Hz,H-5′),6.19(1H,d,J=2.0Hz,H-6),6.49(1H,d,J=2.0Hz,H-8),9.41(1H,s,3-OH),9.71(1H,s,4′-OH),10.75(1H,s,7-OH),12.43(1H,s,5-OH),3.81(3H,s,-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:147.3(C-2),135.9(C-3),175.9(C-4),160.7(C-5),98.3(C-6),163.9(C-7),93.8(C-8),156.3(C-9),103.1(C-10),121.9(C-1′),115.6(C-2′),146.7(C-3′),148.9(C-4′),111.8(C-5′),121.6(C-6′),55.9(C-OCH3)。与异鼠李素标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,跟据以上检测所得数据,与文献[25-26 ]报道的异鼠李素一致,确认化合物11为异鼠李素。

化合物12,黄色固体颗粒,mp 251~253 ℃(MeOH),HCl-Mg 反应呈阳性,Molish 反应呈阴性,示为黄酮类化合物,EI-MS m/z:408[M]+,分子式:C22H16O8,UVλmax nm(MeOH):255,265,373。IRυmax cm-1(KBr):3455(OH),1655(C=O),1615,1520,1435(Ar)。1HNMR(DMSO-d6)δ:6.33(1H,s,H-6),7.73(1H,d,H-2′),6.86(1H,d,H-5′),7.47(1H,dd,H-6′),7.04(2H,d,H-2″,H-6″),6.58(2H,d,H-3″,H-5″),3.96(2H,s,H-7″)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:146.9(C-2),135.7(C-3),176.1(C-4),161.6(C-5),97.9(C-6),158.9(C-7),106.3(C-8),153.6(C-9),103.1(C-10),122.3(C-1′),115.3(C-2′),145.3(C-3′),147.9(C-4′),115.7(C-5′),120.6(C-6′),130.9(C-1″),129.3(C-2″,6″),115.5(C-3″,5″),155.6(C-4″),27.4(C-7″)。与8-对羟基苄基槲皮素标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,跟据以上检测所得数据,与文献[27 ]报道的8-对羟基苄基槲皮素一致,确认化合物12为8-对羟基苄基槲皮素。

化合物13,黄色针状结晶,mp 205~207 ℃,HCl-Mg 反应呈阳性,Molish 反应呈阴性,示为黄酮类化合物,EI-MS m/z:344[M]+,分子式:C18H16O7,UVλmax nm(MeOH):275,345。IRυmax cm-1(KBr)::3455(OH),1645(C=O),1615,1510,1435(Ar)。1HNMR(DMSO-d6)δ:8.05(1H,d,J=1.60Hz,H-2′),7.31(1H,dd,J=1.6Hz,J=8.0Hz,H-6′),7.16(1H,d,J=8.0Hz,H-5′),6.81(1H,s,H-8),6.37(1H,s,H-3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:148.5(C-2),137.5(C-3),176.3(C-4),162.6(C-5),167.5(C-6),164.9(C-7),95.1(C-8),156.9(C-9),103.7(C-10),122.3(C-1′),116.9(C-2′),146.9(C-3′),149.4(C-4′),111.9(C-5′),121.9(C-6′),56.4(C-3′-OCH3),61.1(C-6-OCH3),57.1(C-7-OCH3)。与5,4′-二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮标准品共薄层,多个展开系统的Rf值一致,跟据以上检测所得数据,与文献[14,26]报道的5,4′-二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮一致,确认化合物13为5,4′-二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮(cirsilineol)。

4 讨论

林下种植6个月的金线莲和滇南开唇兰全草提取的有效部位进行初步体外抗癌活性的筛选,用MTT法在体外对人肺癌细胞NCI-H446,spc-A1 进行抑瘤实验,金线莲、滇南开唇兰在浓度为100/μg·mL-1时,对人肺癌细胞NCI-H446抑制率分别为89%和93%,对spc-A1 肺腺癌细胞抑制率分别为90%和95%。 Studen’s t检验,与对照组相比,P<0.001。发现滇南开唇兰的抗癌活性比金线莲略强,因此对滇南开唇兰进行了化学成分研究,探索该植物中抗癌有效的先导化合物。

从滇南开唇兰植物全草中提取分离得到13个化合物,1~13化合物是首次从滇南开唇兰植物全草中分离得到,其中,4个生物碱:anoectosterol(5),anoectochine(7),石杉碱甲(8),ginsenine(9);6个黄酮:芦丁(1),山奈酚(2),槲皮素(4),异鼠李素(11),8-对羟基苄基槲皮素(12),5,4′-二羟基-6,7,3′-三甲氧基黄酮(cirsilineol)(13);2个有机酸:棕榈酸(3),硬脂酸(10),1个内酯苷类化合物:kinsenoside(6)。化合物(5)、(9)在金线莲植物中未见报道。本研究可为完善滇南开唇兰的药效物质基础及进一步的研究开发奠定基础。

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