全反式维甲酸对银屑病角质形成细胞间隙连接通信的影响

梁晓冬 邓新华 李春红 梁景耀 张锡宝

1暨南大学附属顺德医院，佛山，528305；2广州医科大学皮肤病研究所/广州市皮肤病防治所，广州，510095

细胞中的间隙连接通讯(GJIC)是在多细胞生物体中普遍存在的通信模式，其功能由连接蛋白(Cx)实现。目前有关连接蛋白43(Cx43)研究较多，并显示了与银屑病的相关性。全反式维甲酸(ATRA)对银屑病角质形成细胞间GJIC功能的影响及可能作用的途径仍然未知，进一步探究ATRA与银屑病中GJIC关系，将加深对细胞GJIC功能的理解，并为增强药物作用或敏感性及银屑病治疗指出了新的方向。

1 细胞间隙连接通讯

1.1 间隙连接通讯结构 间隙连接通讯(gap junctional intercellular communication, GJIC)是在多细胞生物体中广泛存在的沟通模式，并且其生物效应是通过间隙连接(gap junction, GJ)来实现的。六个单元的连接蛋白(connexin, Cx)聚集体形成连接子或半通道，连接子布置在细胞膜形成亲水性管道，嵌入在细胞质中，相邻区域细胞的两个中央小管连接形成GJ通道[1]。大分子物质如脂类、遗传物质、多糖等不能通过间隙连接通道被输送，但小分子物质如离子、核苷酸、第二信使细胞因子等可以通过间隙连接通道[2]。间隙连接会受到各种分子对Cx蛋白构象的各种影响，间隙连接状态从而发生改变[3]。

1.2 连接蛋白表达与定位 关于连接蛋白26、连接蛋白30、连接蛋白43(Cx26、Cx30、Cx43)的研究较多，它们在角质形成细胞中作用较为突出[4]。单细胞或多细胞生物的体内生命活动的功能和平衡由细胞外囊泡、隧道纳米管或GJ介导。最近的研究表明，Cx43可参与以上所有细胞间介导形式的交流[5]。已有学者证明，Cx26和Cx43共定位/表达于一些角质形成细胞上，银屑病损伤表皮和阴道上皮的双重染色显示两种连接蛋白的表达可部分重叠，某些区域显示Cx26蛋白表达占优势，或Cx43蛋白表达占优势。Cx26和Cx43经常聚集出现在同一细胞膜上。涉及表皮角质形成细胞分化的大多数研究集中强调Cx26和Cx43[4]，同样银屑病角质形成细胞膜中的个别大连接间隙可同时含有Cx26和Cx43[6]。Cx26在银屑病等增生性表皮的基底和基底上角质形成细胞中与Cx43共表达，并且Cx43已被认为可影响GJIC变化并诱导角质形成细胞的增殖[7]。

2 银屑病与细胞间隙连接通讯

2.1 银屑病发病机制及相关因子 银屑病是一种慢性、复发性、炎症性的皮肤病，部分患者具有家族易感史或明确家族史，通常受遗传和环境双重影响，T淋巴免疫细胞参与介导[8]。目前为止，银屑病的确切病因和发病机制有待进一步研究，组织病理学变化主要表现为角化过度、Munro微脓肿、T细胞浸润、真皮乳头的血管扩张[9，10]。有日渐增多的证据表明，角质形成细胞的增殖分化以及免疫系统的活化与银屑病密切相关[11]。角质形成细胞如果出现一系列改变，包括增殖异常、终末分化能力降低、分化成熟周期缩短等，可能诱发银屑病损害的病理变化。白介素22(interleukin-22, IL-22)、IL-23、IL-17，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)都是与银屑病相关联的主要炎性分子[12]。促使炎症的细胞分子如多种白介素、肿瘤坏死因子、干扰素等，以及Th1和Th17免疫细胞，是在mRNA和蛋白质水平上调节Cx43、抑制GJIC功能的主要因素[13-15]。IL-22主要由Th1和Th17细胞分泌并且能够增强这些细胞因子对银屑病发病的影响[16]。 IL-22和这些细胞因子很可能在这期间通过一些共同的潜在机制下调Cx43来影响银屑病活动和GJIC的减少。

2.2 银屑病中连接蛋白变化探究 斑块状银屑病中Cx26和Cx30蛋白的表达显著增强，银屑病的易感性与表皮分化有关，包括E-钙黏蛋白和Cx43的下调以及Claudin13的增强表达，Claudin13是表皮紧密连接的关键组分[17]。早期研究发现，银屑病斑块含有大量的Cx43，这是一种间隙连接蛋白，可以出现在正常的人类表皮中。这种蛋白质在银屑病中的含量略高于对照皮肤，无论是判断为转录水平(northern blot)还是蛋白质水平(免疫荧光)[18]。以上研究似乎表明了此类连接蛋白的表达升高与银屑病皮损加重程度有关，但仍然存在结果不同的研究。Liang等[19]研究旨在探讨Cx43是否在银屑病的表皮和IL-22处理的HaCaT细胞中失调。4例银屑病患者的皮肤标本中的Cx43蛋白表达分别用免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、qRT-PCR和Western印迹评估。 IHC和IF染色显示Cx43蛋白表达主要定位于表皮基底层，并且病变中的信号显著低于三个银屑病患者的非损伤皮肤。然而，在一例银屑病患者中，皮损中的Cx43蛋白表达信号略微降低。此外，qRT-PCR和Western印迹显示出类似的结果。

3 全反式维甲酸药物机制及应用

3.1 全反式维甲酸代谢 全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)亦名全反式维A酸，是维甲酸(retinoic acid, RA)中一员，属于第一代视黄酸药物和维生素A(视黄醇)的天然代谢产物，并且作为干细胞分化的有效诱导剂。ATRA通过单纯弥散的方式进入细胞，之后主要分为两条代谢途径。一方面，它被结合到RA 结合蛋白I(cellular retinoic acid binding protein, CRABP I)上，随即被输送到内质网，经微粒体内的细胞色素P450酶(cytochrome P450 isoform 26, CYP26)分解消化，变成无活性产物；另一方面，ATRA被结合到结合蛋白II(cellular retinoic acid binding protein, CRABP II)上，后被转运至细胞核内，进一步与各种细胞核受体结合，继而影响转录、蛋白质翻译等多种生命活动。细胞色素P450酶亚型共有三种，分别为CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1，起调控体内RA浓度水平的作用[20]。

3.2 全反式维甲酸受体 目前发现细胞内有两种类型的核类视黄醇受体，一种是视黄酸受体(retinoid acid receptor, RAR)，而另一种是类视黄醇X受体(retinoid x receptor, RXR)，其中每种受体具有不同亚型(α，β，γ)，每个亚型具有若干种结构[21]。视黄酸受体通过与维甲酸结合蛋白结合激活，诱导直接基因组靶标的转录。RA诱导的机制是建立稳固的RAR的直接或主要靶标。简言之，RAR /RXR异二聚体与基因组维甲酸反应元素(retinoic acid response elements,RAREs)相关联，与RA配体的结合诱导构象转变，取代阻遏物并有利于共激活剂的募集。此外，RA的主要靶标还可以诱导第二靶标的转录。细胞可以存在多种阶段，比如细胞增殖、凋亡和分化，应答于环境线索的多种改变[22]。

3.3 全反式维甲酸应用 口服或局部使用RA的作用包括细胞增殖的双向调节、细胞分化的双向调节、抑制角质化过程、参与调节免疫活动、抗炎症反应、抑制和灭活痤疮丙酸杆菌、阻断化学致癌过程等作用，尤其是对改善难治性角化性皮肤病、慢性光化性皮肤病和改善皮肤肿瘤进程等提供了新的治疗方法[23,24]。

4 全反式维甲酸对细胞间隙连接通讯影响

4.1 全反式维甲酸影响细胞增殖迁移 ATRA已显示出影响细胞增殖迁移的能力。ATRA以一定剂量和时间依赖方式，显著减少血管内平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖，并降低其迁移。这种RA活性伴随着VSMC 中新型C2H2锌指转录因子(ZFP580)的上调。ATRA与RARα结合通过PI3K/AKT和ERK途径诱导ZFP580表达[25]。此外，已有研究表明ATRA抑制白血病骨髓间充质干细胞的细胞周期过程，阻止细胞生长并促使细胞凋亡增多，可能机制是Cx43表达的上调和GJIC功能的加强[26]。与其他类固醇激素一样，ATRA通过核受体维甲酸受体(RARs)和非基因组引起基因组作用行动。有研究确定细胞维甲酸结合蛋白1 (Crabp1)介导RA的非基因组活性，并识别两个化合物作为Crabp1的配体，能够快速且独立地激活细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)[27]。

4.2 全反式维甲酸对连接蛋白的作用 ATRA已显示在多种不同类型细胞中上调Cx43表达和GJIC的功能[26,28]，尽管在NTera2/克隆D1细胞[29]和p19胚胎癌细胞中报道了一些相反的结果[30]。除了增加Cx43表达水平外，RA还通过增强蛋白磷酸酶2A和Cx43之间的相互作用来上调Cx43的去磷酸化，导致原代人子宫内膜基质细胞中GJIC的增加[31]。已发现特定位点的磷酸化[28]以及Cx43的泛素化[32]可导致GJIC降低。虽未有研究报道RA对Cx43泛素化的直接影响，但已有研究显示原发性急性早幼粒细胞白血病细胞中的泛素样修饰物激活酶3控制细胞周期进程中许多重要蛋白质活动，RA治疗增加了其降解[33]。已经充分证明RA不仅抑制细胞增殖和迁移，而且通过Cx43介导的GJIC增强细胞对抗癌疗法的敏感性[34,35]。

4.3 全反式维甲酸对IL-22和细胞间隙连接通讯影响 IL-22属于白细胞介素10亚群，可以被先天性和后天性免疫系统激活。IL-22升高往往可见于银屑病、间质性肺病、类风湿关节炎等，它们都属于T淋巴细胞参与的疾病[36]。角质形成细胞在IL-22的作用下，一方面可增强分泌多种微生物肽能力，另一方面自身分化、迁移能力也可被抑制[37]。体外研究表明，IL-22向上皮角质形成细胞发出信号，并促使细胞增殖和迁徙。IL-22的信号传导途径经过IL-22、IL-22R1和IL-10R2三元复合物模型发挥作用[38]。目前已知，人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)在IL-22的作用下，细胞增殖活跃且凋亡减弱[39]。有学者把IL-22注射到小鼠耳后细胞发现有大量白细胞浸润和表皮棘层增厚，而在基因敲除小鼠中未观察到上述表现；银屑病患者损害区域中IL-22的表达显著高于普通人群组，在同一对应的银屑病患者中，从病变区分离出的T细胞产生的IL-22水平高于外周血来源的T细胞产生的IL-22水平[40]。人体、细胞实验、动物模型中均有证据支持，IL-22可促使细胞增殖、减少细胞凋亡，在银屑病中呈现高表达水平并加重自身炎症和皮损症状。

IL-22BP是可溶性抑制性IL-22受体，可能是IL-22的重要调控因子。在人类中，未成熟的单核细胞来源DC(MDDC)可由维生素A酸诱导并表达IL-22BP，从而积极参与肠道IL-22活性的调节[36]。IL-22是银屑病致病过程重要的因素，说明ATRA确实通过某些途径对IL-22起抑制的作用。Liang等[19]研究表明，IL-22下调HaCaT细胞中的Cx43蛋白表达并降低GJIC功能，并经过激活JNK传导路径刺激小鼠模型中的银屑病样改变。ATRA治疗银屑病的疗效已被证实，靶向IL-22也可能是治疗斑块型银屑病的一种潜在的治疗方法。换言之，ATRA作为治疗剂，它可影响某些细胞的迁移增殖，可使细胞间连接蛋白Cx43表达水平和GJIC功能强弱发生变化。ATRA对于人体表皮细胞的增殖迁移的影响尚未阐明。另一方面，IL-22作为重要的致炎因子，也已有证据支持它具有调节连接蛋白和细胞间连接通讯的能力。迄今未知ATRA在人体内发挥作用过程中，是否涉及到IL-22这个关键因素。ATRA与IL-22之间可能存在某种联系，它们之间的途径机制值得进一步探究。目前已知与银屑病有关的通路较多，包括有JAK-STAT、Wnt、p38、JNK、AKT和ERK1/2通路等[41,42]，而ATRA对银屑病角质形成细胞间GJIC功能的影响及可能作用的途径仍然未知。

5 小结

目前研究发现，ATRA对多种细胞间GJIC功能产生影响，但其对银屑病表皮细胞中GJIC功能作用仍然未明。IL-22可影响HaCaT细胞中Cx43和GJIC变化，人体内环境的变化是多种综合因素作用的共同结果，在银屑病发生、进展、转归不同过程中，ATRA、IL-22系统变化和其余未知因素可能参与共同作用。进一步探究ATRA与银屑病中GJIC关系，将拓展和增强细胞间隙连接通讯功能药物、增强药物敏感性的理解，并为银屑病治疗指出新思路。