共培养技术在耳软骨再生中的应用及展望

林阳洋 潘博

中国医学科学院整形外科医院整形七科

小耳畸形的治疗是整形外科的重点和难点，在我国发病率约为3.06/10 000[1]。目前有三种耳廓重建方法:自体移植物，人造移植物和外部假体移植。然而，自体肋软骨雕刻难度较高，且可造成胸廓畸形;而人工支架植入可有感染、移植物排斥和外露等风险。需要更好的耳廓重建方案[2]。组织工程制作耳廓软骨植入物，可以避免上述风险，应用前景广阔。种子细胞是组织工程技术中所用到的所有细胞的总称。如何获得足量的耳廓软骨种子细胞（Auricle Chondrocytes，AuCs）进行组织工程耳再造仍有待进一步研究。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）可以分化成软骨细胞，作为软骨工程种子细胞的替代来源。单独培养转化软骨细胞或MSCs需要较长的时间，增加了感染的风险，分化方向难以控制，常伴有肥大，继而钙化，导致力学性能不佳。所以单一使用软骨细胞或MSCs目前对头颈区域的基于细胞的软骨修复并不理想[3]。面对细胞单独培养的困境，软骨组织工程提出了共培养体系。本文对共培养体系在软骨再生中的应用进行了全面的综述，并比较了直接共培养体系和间接共培养体系的差异，讨论了其潜在的机制及新的进展。共培养研究在关节软骨（Articular Chondrocytes，ACs）等生物工程领域得到大量应用，相应的进展给耳廓软骨生物工程带来很多启发。

1 共培养体系

共培养体系即是建立类似于体内环境的培养体系，尽可能使体外环境与体内环境相吻合，从而使细胞间能相互沟通信息，相互支撑生长增殖，在细胞培养技术的基础上发展出了细胞共培养技术。而细胞共培养技术是将2种或2种以上的细胞共同培养于同一环境中，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。传统软骨组织工程以自身软骨细胞作为种子细胞，存在来源不足等问题，限制了其临床应用。近年来，多种来源的干细胞因其较强多向分化潜能、易从身体不同部位大量获取等优点，成为软骨组织工程种子细胞的新来源。基于干细胞的共培养体系给软骨组织工程研究提供了新的方法。

共培养体系可以获得充足的软骨工程种子细胞数量，具有减少软骨细胞的去分化等明显的优势。然而，大多数关于共培养的研究是基于颗粒或微量培养的ACs，对MSCs/AuCs共培养和共移植软骨形成的研究还很少。Dlk1在成年猪AuCs中强烈表达，表明成熟AuCs与关节软骨中增殖/前增生性区域的ACs处于相似的状态[4]。ACs共培养的研究成果可能为工程耳软骨的临床转化提供有希望的策略。

组织工程再生耳至少需要1.5亿个AuCs，但最初只能分离出200万个AuCs。尽管AuCs增殖稳定，但在重复单层传代过程中，软骨细胞表型和能力迅速丧失，这是一种常见的去分化现象，很难避免。最终，去分化导致纤维软骨形成，其功能远不及透明软骨。Zhang等人利用小耳畸形耳廓软骨细胞和牛MSCs共培养发现，尽管小耳畸形耳廓软骨细胞有很强的增殖能力，但是在3代以后的单独重复传代中，其成软骨能力迅速丧失[4]。

研究如何在获取充足的软骨种子细胞数量的同时避免或减少去分化程度对耳廓软骨组织工程具有重要意义。关于MSCs在共培养介导的软骨形成中的作用和机制，目前有两种观点。一个观点是MSCs可由软骨细胞诱导并可直接转化为软骨细胞样细胞，通过骨髓MSC（bMSCs）标记、transwell分离共培养、软骨细胞条件培养基等多种方法得到证实；另一个观点是MSCs可以通过营养效应促进软骨细胞的增殖和软骨特异性（extracellular matrix，ECM）的产生。因此，这两种机制很可能是共存的，MSCs和软骨细胞可能是相互协同的。共培养对软骨形成的作用机制尚未完全阐明。为了探讨细胞间在共培养体系中的相互作用、可行性和有效性，Jianyu Zou等[5]提出了两种共培养体系，即直接共培养体系和间接共培养体系，有助于揭示共培养体系在软骨再生中的机制，为共培养体系在软骨组织工程中的应用提供了理论支持。通过共培养策略建立基于MCs和干细胞的、成本更低、软骨形成更稳定的软骨组织再生技术，可以为工程人耳软骨组织的临床转化提供一种促进策略。

2 直接共培养体系与软骨再生

直接共培养体系是将两种或两种以上的细胞均匀混合，不同来源的细胞密切接触，通过表面受体和分泌的各种细胞因子相互作用。直接共培养体系可以进一步分为单层直接培养（细胞直接混合），以三维直接培养（包括支架或水凝胶共同培养）。与单层培养相比，三维培养能较好地维持软骨细胞的自然表型[6]。近年来，利用水凝胶颗粒作为共培养支架成为研究热点。软骨细胞-软骨细胞共培养，以及软骨细胞-间充质干细胞共培养，前者研究较少，研究主要集中于软骨细胞和MSCs的结合。

2.1 直接共培养体外研究

大多数ACs可以被bMSCs替代，缓解软骨细胞分离和扩张带来的问题。无论去分化处于哪个阶段，在合适的诱导培养基中，去分化牛ACs细胞与兔bMSCs共培养均可产生软骨形成[7]。与单一培养相比，共培养的牛ACs和兔bMSCs对TGF-β3有更高的敏感性[8]。与MSCs共培养时，软骨细胞表型更加稳定，Col II、糖胺聚糖和转录因子Sox9增加[9]。共培养显著减少了所需的软骨细胞数量，增强了MSCs的软骨形成，减少了体外增殖过程中的去分化，避免了纤维软骨的形成[10]。两种细胞类型之间的密切接触是共培养的先决条件，这种相互作用改善了受体MSCs的生存能力、软骨形成、基质形成和稳态。细胞内的内容物从共培养的软骨细胞向向邻近的MSCs转移，而抑制胞外囊泡(EV)转移阻碍了共培养的协同作用，EV可能是这些共培养中主要的交流方式[11]。

很多实验研究关注共培养的比例问题。多数研究提示软骨细胞和MSCs（1:1）效果最佳，而另一些表明1:3、3:7和1:4比例可以产生更高的聚集蛋白和胶原蛋白含量。Elhussein Elbadry Mahmoud甚至尝试了多种干细胞共培养的方案，bMSCs和滑膜间充质干细胞sMSCs（1:1）两种细胞混合的抗炎特性有望改善骨关节炎的临床症状。之后需要进一步的研究来评估共培养体系中最佳的sMSCs/bMSCs比例，以便在体内和体外通过长期评估来评估骨软骨发育潜能[12]。以上体外ACs和bMSCs的共培养可减轻工程关节软骨的肥大，增强其功能特性。在耳廓软骨组织工程方面，u Zhang[13]等采用AuCs：bMSCs（1:3）共培养，结果表明MCs具有很强的软骨诱导能力，可以促进bMSCs在皮下环境中稳定的异位软骨形成。康宁[4]等发现1:1组工程软骨弹力蛋白密度最大，杨氏模量最高。Ki67和Dlk1的表达增强，显示工程软骨较好的增殖和成软骨潜能。Dlk1是Notch/Delta/Serrata家族的跨膜蛋白，被认为是软骨祖细胞的标记物，在小鼠肢体软骨内成骨过程中由增生性向增生性前软骨细胞过渡的细胞中特异性表达。Dlk1在成年猪耳软骨细胞中强烈表达，表明成熟耳软骨中的软骨细胞与关节软骨中增殖/前增生性区域的软骨细胞处于相似的状态。LMieke M.Pleumeekers等[3]将牛AuCs和人bMSCs（1:4）包覆在海藻酸水凝胶中，发现产生的软骨基质成分与100%牛软骨细胞对照组相当。然而该共培养体系非常脆弱，外植体未显示软骨样外观，这对其结果的持久性产生了疑问[3]。相比之下，Kerry A Morrison等[14]在I型胶原蛋白水凝上共培养牛AuCs和牛bMSCs（1:1），发现产生的弹性软骨甚至比100%AuCs培养物更强健，表明MSCs的存在引发了耳廓软骨合成。在AuCs和bMSCs共培养的研究中，1:1的比例较为多见，且均显示良好的结果，因此从现有证据看，1:1的比例较为适宜AuCs和bMSCs的共培养研究。

除骨髓外，脂肪MSC（ADSCs）和软骨细胞共培养,可定向分化为软骨细胞。ADSCs与ACs以不同比例直接共培养于胶原／透明质酸构成的3D支架中35天，1:3共培养组人ADSCs的Sox9、糖胺多糖含量最高，Ⅹ型胶原表达量最低。耳软骨也可采用ADSCs进行共培养，且以3:7的比例相对多见[15,16]。有一篇报道[17]尝试1:5和1:10的比例直接共培养AuCs和ADSCs，也可以得到软骨组织，但是观察时间较短，构建物数量较少，分子机制有待进一步揭示。

有研究尝试脐血或脐带来源的MSCs（umbilical cord mesenchymal stem cells，uMSCs）与 ACs共培养。uMSCs：MSCs（1:1和1:3组）细胞支架复合体总蛋白量高于其他组[17]。将uMSCs和人ACs（5:1）直接共培养，可明显促进人uMSCs向软骨样细胞诱导分化，并有效抑制细胞纤维化，缩减软骨细胞用量[19]。1:1的比例下，即使低密度共培养（比其他共培养研究低约400倍），依然有充足的软骨产生和良好的再分化效果。然而，也有uMSCs与ACs共培养成软骨能力较差的报道[20]。未来的实验需要进一步研究uMSCs分泌的特异性细胞因子及其信号通路。uMSCs来源的研究展示出良好的抗炎和抗去分化的特点，大多数uMSCs共培养中的成软骨能力优于bMSCs，且所需软骨细胞比例小于bMSCs和ADSCs共培养，可以考虑uMSCs在耳廓工程中尝试应用。

2.2 直接共培养动物体内研究

随着体外研究取得进展，出现了越来越多的动物体内共培养构建的尝试。兔MSCs及软骨细胞（3:1）混合接种于PGA(聚羟基乙酸)支架共培养并种植在成兔皮下,体内培养8wk发现新生软骨外观及组织学特征良好。研究者认为软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成[21]。Zhou等[22]建立了体内软骨形成生态位，以控制外源性MSCs的分化方向。他们证实猪ACs分泌多种可溶性因子，并形成软骨生态位，诱导bMSCs稳定的成软骨。该共培养体系有望修复鼻、耳等缺乏软骨形成生态位的皮下软骨组织损伤。在大鼠[23]和兔子[24]的软骨缺损中，静电纺丝PCL[23]和光交联PCL-peg-PCL[24]等支架共培养体系具有很大的软骨再生潜力。Elbadry Mahmoud等[12]建立股骨内侧髁骨软骨模型，发现sMSCs/bMSCs多种干细胞共培养的模式能更好的填充骨软骨缺陷，表面更加光整。

耳再造方面，Li等建立了软骨细胞板来包裹骨髓基质细胞工程软骨，将其植入裸鼠皮下[25]。该方法为维持软骨表型提供了一种成软骨环境。值得注意的是，小耳畸形软骨细胞具有更强的增殖能力和软骨诱导能力，为共培养MSCs创造了一个良好的软骨形成生态位[13]。尽管有体内AuCs和ADSCs（1:10）共培养的报道[17]，但是该研究所产生软骨成分（纤维软骨还是弹力软骨）不清，其分子机制也未得到揭示，且体内观察时间较短（4周）。与之相比，Mieke M.Pleumeekers将AuCs和bMSCs在裸鼠体内皮下植入8周，首次成功构建了基于干细胞来源的人耳工程软骨组织[3]。然而，该皮下埋植后的软骨弹性模量约为人耳或鼻软骨的1%，未来可能需要机械结构稳定的支架辅助；且细胞数量和密度与临床所需尚存在明显差距[3]。这些来自体内研究的进展为今后临床前或临床试验提供了充分的理论基础。未来的研究在降低耳廓软骨来源细胞比例的同时，应进一步加强共培养工程软骨组织的机械特性。静电纺丝PCL[23]和光交联PCL-peg-PCL[24]等体系在构建耳廓软骨膜，分隔软骨核心和外被皮肤方面具有广阔的发展前景。对耳廓软骨共培养体内研究的机制不充分，关节软骨中常用的间接共培养系统[26,27]可能是揭示耳廓软骨共培养分子机制的有力策略。

3 间接共培养体系与软骨再生

间接共培养体系使用半透膜在物理空间中把不同的共培养细胞分隔开来，使得细胞可以通过释放各自的可溶性因子进行交流。可溶性因子对细胞功能有显著影响，特别是对MSCs等具有较高可塑性的细胞类型。此外，间接共培养具有一定的优势，能够从形态上清晰的观察MSCs与软骨细胞在共培养中各自的大体形态及相应的ECM分泌变化，且有研究表明间接共培养体系可比直接共培养表达更多的蛋白多糖及胶原物质[28]。间接共培养体系也分为单层方式和三维方式。旁分泌等营养效应的具体诱导作用机制，可以使用间接共培养的方式进一步研究。

3.1 间接共培养体系中MSCs对软骨细胞的作用

在共培养体系中，软骨细胞的增殖或者再分化是由MSCs分泌的营养因子刺激的，而ECM主要来自于软骨细胞而不是软骨性MSCs。MSCs具有营养、抗炎和免疫抑制作用，通过调节T和B细胞诱导抗炎症因子的表达，如白细胞介素10(IL-10)、IL-1受体拮抗剂(IL-1 RA)或前列腺素E2(PGE2)。间接共培养人牙髓干细胞(DPSCs)和人ACs，DPSCs通过STAT1途径抑制金属蛋白酶3（MMP3）和MMP13的表达，证实局部注射DPSCs可能对进行性颞下颌关节关节炎的治疗作用[29]。ADSCs可通过诱导滑膜分泌具有软骨保护作用的液体因子(如软骨细胞增殖和软骨基质保护)来抑制软骨退变的进展[30]。Karperien等的一项实验表明，不同来源的MSCs和软骨细胞共培养时，MSCs展示出相似的营养促进效果，提示共培养对培养条件和MSCs的来源依赖性不高，有一定的独立性[28]。然而，Acharya等[31]的研究表明，人ACs或鼻中隔软骨细胞与人bMSCs或ADSCs在共培养体系中具有协同作用。尽管大多数MSCs已经凋亡，MSCs在不去分化的情况下促进软骨细胞的增殖，而剩余的由软骨细胞诱导的MSCs则表现出较强的成软骨能力。在间接共培养体系中，MSCs还通过旁分泌信号抑制软骨细胞分化[32]。Zhihua Han等[26]在间接共培养体系中，结合微阵列分析和生物信息学技术，首次全面鉴定了与ASCs共培养改变的退化性髓核软骨细胞的差异表达lncRNA和mRNA，揭示了基因表达调控模式。目前，尚未见耳廓软骨细胞间接共培养的研究，上述共培养的实验提示共培养存在一定的依赖细胞来源的可能，但是还有争议。通过间接共培养研究与耳廓软骨细胞产生协同效应的MSCs，以及借鉴生物信息学技术等深入挖掘其特殊的营养效应机制和基因调节网络，值得进一步探讨。

3.2 间接共培养体系中软骨细胞对MSCs的作用

大多数实验显示间接共培养中软骨细胞诱导MSCs向软骨细胞分化。在有软骨细胞的Transwell系统中培养的人胚胎干细胞表达II型胶原，GAG产生增加[33]。软骨细胞的生长因子可以诱导条件培养基（CCM）中的bMSCs成软骨分化，效果甚至高于TGF-β3 标准培养基[34]。Qi Zhang等[35]体外建立Transwell体系接种ADSCs和软骨细胞。发现ADSCs和软骨细胞在共培养组中比在单培养组中迁移更少，而迁移距离是判断细胞去分化程度的重要指标之一[20]。共培养组中丝状伪足的减弱抑制了迁移，下调的MMP-2降低了ECM重塑，上调的Vinculin抑制细胞迁移。Notch信号通路可能参与了这一过程。

然而，软骨细胞来源的因子并不总是促进软骨形成或者维持表型。常氧条件下鼻软骨细胞可产生炎性因子，弥散通过Transwell诱导肥大软骨形成，MMP13升高，降低GAG基质和ACAN基因表达，降低共培养工程软骨的成软骨潜能。该实验从一个侧面反应出共培养体系和其它调节因素联合的重要作用。低氧是促进软骨分化的常规条件之一，在常氧等不合适条件下，即使共培养也不足以改变软骨细胞去分化的趋势。

4 共培养体系和其它转化因素的综合应用

有研究尝试在共培养体系与其他条件同时作用，进一步促进软骨细胞增殖转化。将KGN加入到Col-Tgel水凝胶中可为BMSCs和/或ACs的软骨再生提供适宜的微环境[36]。对共培养的bMSCs和ACs进行周期性正弦动态力学刺激，既提高了软骨细胞的增殖能力，又改善了共培养细胞的软骨表型[37]。TGF-β家族BMP-SMAD信号转导是细胞定向分化的关键事件之一。Chen,M.J.等[38]建立数学模型描述共培养中TGF-β的作用，发现内源性TGF-β作用下，如果软骨细胞的初始比例超过一个临界值，就会诱导完全软骨形成；外源性TGF-β作用下，则存在一个关键浓度点，是诱导MSCs完全软骨形成的必要条件。

5 结论与启示

耳软骨工程种子细胞的数量有限和去分化等问题，限制了生物工程技术在耳廓软骨再造的进一步发展。共培养体系有助于解决单一培养在软骨组织工程中遇到的诸多问题。然而，潜在的机制仍然不清楚。共培养研究大部分都是关于干细胞与ACs的共培养，耳软骨细胞的共培养研究较少。此外，干细胞和软骨细胞常常在直接共培养环境中混合在一起，从而混淆了两种不同细胞群间基质形成的贡献。耳廓软骨共培养分子机制可以借鉴关节软骨中常用的间接共培养系统，以及基因微阵列和生物信息学等方法得到揭示。1:1的MSCs、3:7的ADSCs与软骨细胞共培养的比例相对多见，但是对于残耳来源的组织工程耳，可能软骨种子细胞来源仍然有限，部分无耳畸形的患儿甚至可能考虑从健侧获取种子细胞，进一步限制了软骨工程细胞的可用数量，因此需要进一步降低共培养中AuCs的比例。成软骨能力更强且所需软骨细胞比例更少的uMSCs可能是一种新的选择，两种以上的干细胞共培养的方案[11]也值得尝试。共培养系统与其它条件的综合使用也是软骨工程的发展方向之一。Chen,M.J.[38]等的模型建立不但揭示了TGF-β家族在软骨细胞共培养中的数学关系，也有望揭示软骨细胞和各种MSCs的比例问题，进一步运用在软骨细胞共培养诱导技术中。期待在耳廓软骨组织工程研究中进一步探索共培养与其它因素的综合应用。