对Hensen细胞在耳蜗K+循环中角色的新认识

石敏于宁丁大雄文艺杨风波胡一勇,李兴启吕萍*

1川北医学院附属医院耳鼻咽喉科(南充637000)

2中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部，国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心聋病教育部重点实验室，聋病防治北京市重点实验室（北京100853）

耳聋是人类的常见疾病，据第二次全国残疾人抽样调查结果显示我国有听力障碍者约2000万，占残疾人总数的25%，位居各类残疾之首[1]。而听觉形成的起点位于耳蜗，在耳蜗中，外毛细胞(outer hair cells,OHCs)的电活动起着对声音刺激进行主动放大的作用[2]。OHC这种高度敏感的功能需要一个极其有利的微环境，而现在越来越多的研究认为OHC周围的支持细胞可以提供这个精细的微环境，同时维持Corti器的离子平衡。除了既往认为这些支持细胞仅仅起到支撑毛细胞、维持基底膜结构稳定的作用上Smith等人[3]更加深入的研究了Hensen细胞在耳蜗功能的调节中起着至关重要的作用。Smith首先测量并报道了内淋巴液中K+浓度超过了150 mM，耳蜗中钾离子循环的形成主要是由于高K+可以通过外毛细胞及支持细胞之间的缝隙连接到达内淋巴[4]。既往对钾离子循环主要侧重于研究血管纹细胞的作用，而有关支持细胞的作用研究甚少，尤其是Hensen细胞在钾离子循环中的作用。本文回顾Hensen细胞的最新研究成果，对Hensen细胞调节耳蜗K+循环中扮演的角色以及Hensen细胞在内耳疾病发生和发展的理论与实践做一综述，以进一步认识Hensen细胞在耳蜗中的重要作用。

1 Hensen细胞在K+循环中的重要作用

目前认为，耳蜗内淋巴的高K+浓度是由血管纹边缘细胞产生[5]，当毛细胞受到声音刺激时，可将声信号转换成电信号，毛细胞的机械电活动使钾离子外流，因此在毛细胞附近的蓄积的大量钾离子可经多种不同途径循环进入内淋巴，但目前关于这些可能的循环通路还未得到足够的实验证据来支持。根据多年研究，有学者认为支持细胞可能在维持钾离子循环中扮演着非常重要的角色，因为经测试淋巴流动电流提示，内淋巴中的高钾离子最终可经螺旋韧带进入血管纹[6,7]，再由血管纹分泌至内淋巴中。哺乳动物Corti器中主要的支持细胞群包括Hensen细胞和Deiters细胞，它们位于靠近外毛细胞外排的基底膜上，并通过缝隙连接相连，从而形成胞质合胞体，提供离子和代谢连接[8,9]。此外，Alexander[10]指出Hensen细胞可以缓冲外毛细胞附近蓄积的钾离子，并为毛细胞附近高钾离子向螺旋韧带转运提供通路[11]。Hensen细胞的钾离子缓冲功能对听功能很重要，因为K+代表着内淋巴中的主要阳离子，也是感觉传导的主要电荷载体。而这一钾离子缓冲功能涉及到K+通道外向整流[12,13]以及支持细胞间的缝隙连接耦合[8,14,15]。Alexander[10]利用全细胞膜片钳技术发现细胞内ATP的缺失可导致耳蜗中Hensen细胞缝隙连接解耦，由此提出了一种假说，细胞内ATP使对ATP敏感的内向整流性钾通道（Inwardly rectifying K+channels,Kir通道）处于封闭状态，从而维持Hensen细胞的缝隙连接耦合。而在豚鼠耳蜗组织免疫荧光染色进一步首次显示了ATP敏感的Kir通道亚单位Kir6.1和其受体（Subunits Receptor1,SUR1）在Hensen细胞中的表达，支持了上述假说。所以我们可以推测ATP敏感的Kir通道作为Hensen细胞缝隙连接偶联的调节因子，很有可能是支持细胞代谢状态与Corti器钾离子循环之间的生理联系。

缝隙连接是细胞间进行直接信息物质交换的通道，允许代谢物、离子和小信号分子与邻近细胞交换，缝隙连接通道是由连接子半膜形成的，连接子半膜与相邻膜上的连接子连接。每个连接子由连接蛋白(Cx)的六聚体组装而成[16]。目前已在小鼠基因组中发现19个Cx基因，在人类基因组中发现20个Cx基因，分别在不同的细胞类型中特异表达和调控[17]。于飞[18]等人指出GJB2基因突变可使产生的缝隙连接蛋白缺乏正常功能，而缺乏正常功能的缝隙连接蛋白可降低细胞间缝隙连接通透性，从而无法正常开启连接通道，导致细胞间信息的传递受阻或紊乱，这将严重影响钾离子的循环，从而导致严重的听力下降。Blodow[16]等人的实验是首次研究了钙调素拮抗剂对单个Hensen细胞缝隙连接耦合的影响。Blodow采用全细胞膜片钳技术，进一步分析了钙调素(CaM)拮抗剂W7、三氟哌啶(TFP)和钙调素抑制肽对Corti器官Hensen细胞缝隙连接偶联的影响，在umol范围内加入常规CaM拮抗剂W7和TFP，延迟数分钟后，缝隙连接电导率迅速呈剂量依赖性下降，而钙离子浓度无明显变化。该实验结果表明，W7和TFP在钙离子浓度不变的情况下可以诱导Hensen细胞缝隙连接解耦。另有研究发现，听觉创伤实际上降低了耳蜗中CaM的表达[19]，所以我们有理由推测，相应的CaM依赖性缝隙连接耦合的降低削弱了Hensen细胞在钾离子循环中的功能作用。然而，通过直接与Hensen细胞的主要缝隙连接蛋白结合来实现CaM依赖门控的明确证据仍未找到。目前，有关CaM与钙离子调控耳蜗Hensen细胞缝隙连接电导进而调控钾离子循环的分子机制有待进一步研究。

耳蜗内的支持细胞为毛细胞提供物质支持和营养，在维持耳蜗离子稳态方面发挥重要作用[20,21]。ATP是一种重要的细胞外信号分子，可以激活嘌呤能(P2)受体，产生内向的阳离子电流，提高内外毛细胞内钙离子浓度，从而改变声音转导和神经传递[22-26]。P2受体有两个亚群:ATP门控的电离能(P2X)受体和G蛋白偶联的偏代谢能(P2Y)受体，P2X和P2Y受体均在耳蜗支持细胞中表达[27-29]。Zhu等人[30]研究发现ATP可以通过激活P2X受体介导耳蜗支持细胞钾离子的吸收和循环，在耳蜗离子动态平衡中发挥重要作用。根据以上众多学者研究我们可以推测，在声音刺激时，毛细胞受到了机械刺激，离子通道开启，钾离子由内淋巴进入毛细胞，毛细胞兴奋后将钾离子排出至组织间隙，再被Hensen细胞、Deiters细胞等支持细胞所摄取，而上述支持细胞所产生的外向性钾电流可进一步将多余的钾离子从支持细胞排出，依次转运至螺旋韧带，最终到达血管纹，再由血管纹泵入内淋巴，从而维持毛细胞微环境中钾离子循环及其平衡[31-33]。由此可见，Hensen细胞对耳蜗微环境尤其是钾离子循环和平衡非常重要。

2 Hensen细胞维持EP与钾离子平衡电位的作用

耳蜗蜗内直流电位（endocochlear potential），旧称内淋巴电位（endolymphatic potential），起源于血管纹。正常耳蜗毛细胞内的静息电位值大约为-60mV，哺乳动物类耳蜗的EP大约在+80mV，由此可得出在正常耳蜗毛细胞纤毛的内侧与外侧的绝对电位差值为+140mV，因此有人把EP比喻为耳蜗的“电源”，一旦EP因血管纹功能障碍而丧失毛细胞表皮板两侧的电位差，则所有耳蜗生物电反应和声—电转换功能都将消失[34]。

EP与中阶的高钾离子浓度密切相关，尽管血管纹是产生EP的结构早有定论，但是具体的机制还不完全清楚。由于边缘细胞上特有的钠钾泵的分布，以及边缘细胞内部有比EP还高的正电位[35]，所以大多学者认为EP的产生和钾离子的分泌来源于血管纹边缘细胞。而在最新文献中发现血管纹基底细胞有一种KCNJ10基因编码的特殊钾离子通道[5]，目前认为，该通道是产生EP的基础，边缘细胞更多是维持钾离子转运，从而间接帮助基底细胞产生EP，即边缘细胞可通过从血管纹纹内间隙吸收钾，与此同时再将钾离子分泌入内淋巴，从而协同基底细胞共同维持纹内间隙中的低钾浓度[36]。其主要理论依据是因为Salt的电生理实验表明在基底细胞边界可产生EP，边缘细胞边界无EP产生[37]；由于内向整流钾电流与EP对药物的敏感性具有相似性，Takeuchi[38]在实验中证明EP对钾离子通道阻滞剂敏感，由此可提示钾离子通道有直接产生EP的作用。Ando选择了一种对EP敏感的钾离子通道阻滞剂，将该种钾离子通道阻滞剂作用于KCNJ10钾离子通道，结果发现KCNJ10钾离子通道仅存在于基底细胞，并未在边缘细胞中发现该通道[39]；而Marcus[40]采用基因敲除的实验证实了分布于基底细胞的KCNJ10钾离子通道在EP产生中的作用至关重要；更有趣的是Carlisle[41]研究基因突变的小鼠，发现当抑制血管纹中间细胞的存活，可以得到EP正向成分消失的结果，并且发现基底细胞与中间细胞有丰富的间隙连接，中间细胞缺失的动物不能产生EP，进而推测他们可能在功能上是一个整体。李建雄[42]在实验中给予钾通道阻断剂阻断钾电流后，再给予ATP刺激时在Hensen细胞上没有记录到内向性离子流，证明Hensen细胞上的电压依赖性钾电流参与了耳蜗中钾离子循环。因此内淋巴中的高钾主要来源于血管纹中基底细胞、边缘细胞等多种细胞的协同活动，血管纹中多种细胞的协同活动与耳蜗内外毛细胞、支持细胞等参与构成钾离子循环，钾离子循环对于维持内外淋巴之间钾离子的浓度差和维持正常耳蜗功能有着至关重要的作用[43]。综上所述，我们基本可以确定钾电流参与了EP的形成，EP实际上是钾离子平衡电位[44,45]。

3 Hensen细胞与内耳疾病

如前所述，Hensen细胞对耳蜗钾离子循环和平衡非常重要，EP的产生与维持首先需依赖于血管纹的功能。有实验证明先天缺失血管纹中间细胞（或是后天抑制血管纹中间细胞的存活）可引起EP的降低甚至消失，进而造成引出听神经复合动作电位（compound action potential,CAP）所必需的声压强度阈值的升高，导致重度耳聋[46]。如果血管纹的血液供应或者能量代谢被中断，即中阶高钾离子环境被破坏，可迅速导致EP下降，毛细胞表皮板两侧电势差降低，进而引起毛细胞的感受器电位和神经元的动作电位下降，换言之，EP下降可直接影响耳蜗电位，如微音器电位（cochlear microphonics potential,CM）[5]。一旦内耳Hensen细胞受损，则进一步可破坏耳蜗中阶内钾离子平衡环境，耳蜗的“电源”EP受到影响，造成毛细胞表皮板两侧的电动势消失，将导致毛细胞上的机械门控离子通道的活动和耳蜗内其他电活动无法进行，这对于临床上很多内耳疾病的病理机制提供了新的理论依据。

耳蜗在结构以及生理功能方面类似于人类中枢神经系统的血脑屏障，所以大部分观点认为耳蜗是一种具有免疫特性的器官[47]。如噪声性耳聋、爆震性耳聋以及药物性耳聋等，都与耳蜗炎症反应及耳蜗内外淋巴液中离子活动密切相关。而其中与Hensen细胞密切相关的是参与调节耳蜗炎症反应的Annexin蛋白（ANXA1）[48]：ANXA1是一种脂质和钙离子结合蛋白，且已经发现了在豚鼠耳蜗中阶（SM）的上皮细胞中表达，Kalinec等[48]进一步发现ANXA1在Hensen细胞的脂滴内大量储存，而ANXA1相关受体FPR2/ALX则广泛分布于耳蜗上皮。

支持细胞（包括Hensen细胞和Deiter细胞）通过缝隙连接广泛连接，这是相邻细胞间维持听力功能最重要的通讯通路之一[49,50]。由缝隙连接蛋白β2和β6（分别为GJB2和GJB6）编码的connexin26（Cx26）和connexin30（Cx30）是耳蜗缝隙连接的主要蛋白亚基，其中GJB2突变是遗传性感音神经性聋最典型的病因[51]。此外，老化过程被认为与活性氧对线粒体的损伤有关[52]，而活性氧的产生与支持细胞间缝隙连接的表达和功能的改变有关，并影响连接蛋白的表达[53]，因此，Cx26可能受到耳蜗支持细胞间氧化应激的影响，从而导致与年龄有关的听力损失（Age-related hearing loss,ARHL）。

内耳疾病中，噪声性聋与钾离子和钙离子关系密切[49,54]。正常耳蜗功能与耳蜗中钾离子循环息息相关，其中支持细胞（包括Hensen细胞和Deiter细胞）不仅参与维持钾离子循环过程，还具有缓冲Corti器内外淋巴中的离子浓度，以及调制毛细胞活动等重要作用[31]。Chen[55]等人的研究证明，ATP是机体内一种重要的调质，而且可同时在内外淋巴液中表达，他们发现在给予豚鼠噪声暴露时，耳蜗内ATP会明显增加，此时给予ATP受体拮抗剂则可以明显降低耳蜗毛细胞对噪声刺激的敏感性，从而减轻噪声引起的听力损失。李建雄[56]在实验中证明高浓度的ATP可以介导Hensen细胞产生非选择性内向性离子流，该离子流与钾通道有非常紧密的联系，由此我们可以推测，当机体受到噪声的刺激，耳蜗内ATP会明显增加，而高浓度ATP可以引起Hensen细胞产生非选择性内向性离子流（主要是钾电流），从而影响耳蜗钾离子循环及耳蜗功能。杨风波[57]等人将豚鼠耳蜗Hensen细胞单独分离出来探究其脂滴的性质与分布特点，该实验提出了一个假设：内耳毛细胞实现听觉换能过程的物质基础是充足的能量供应，外毛细胞可能可以利用Hensen细胞中的脂类物质供能，但是有关Hensen细胞功能对内耳疾病的影响机制有待进一步研究。

4 小结

综上所述，近年来，耳蜗支持细胞在听觉功能中的作用成为研究热点，在最新研究中发现，Hensen细胞在内耳钾离子循环中扮演着重要的角色。众所周知，EP与中阶的高钾离子浓度密切相关，一旦钾离子循环受阻，可迅速导致EP下降，可见Hensen细胞对耳蜗功能的调节起着至关重要的作用。此外，Hensen细胞还参与了许多内耳疾病机制的发生，如噪声性耳聋、爆震性耳聋等。现阶段有关Hensen细胞的研究还较少，进一步有关Hensen细胞在耳蜗微环境中的角色的研究将会为探讨耳蜗疾病的发生机制提供新的理论和实验依据。

致谢

衷心感谢李兴启教授对本文的悉心指导。