RECK基因在头颈部鳞状细胞癌中作用的研究进展

李文文 宋少鹏 马秀岚

中国医科大学附属盛京医院耳科(辽宁117004）

鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)简称鳞癌，又名表皮癌，起源于皮肤表皮及其附属器(毛囊漏斗、皮脂腺导管、末端汗管)角质形成细胞，多见于有鳞状上皮覆盖的部位，如皮肤、口腔、唇、食管、子宫颈、阴道等处。头颈部鳞状细胞癌（Squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN)是全球第六大恶性肿瘤[1]。尽管外科、放疗、化疗等多学科综合治疗方法在临床应用数十年，但SCCHN患者预后仍较差[2]。转移是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)患者高死亡率的主要原因之一[3,4]，因此阐明其潜在机制可能有助于有效监测肿瘤进展，提高SCCHN患者的生存结局。近年来恶性肿瘤侵袭及转移的机制研究已进入分子生物学的水平，细胞外基质(ECM)和血管基底膜的降解是恶性肿瘤浸润和转移的关键环节。组织和细胞的生长离不开细胞外基质(ECM)所创造的细胞微环境，肿瘤的浸润和转移牵涉到穿透ECM和血管壁层基膜、进入细胞微环境等诸多过程。病理过程涉及肿瘤细胞脱离原发瘤体，浸润在周围间质中生长，并通过脉管系统或腔道被转运到靶组织，最终形成转移灶的过程。RECK基因是一种新型基质金属蛋白酶抑制剂，可在转录后水平抑制多种MMPs的表达，进而有效地抑制肿瘤的侵袭与转移。

1 RECK的结构和表达

RECK基因是1998年由日本学者Takahashi等在v-ki-ras转染细胞株NIH3T3中发现的新型转录抑制基因。RECK基因定位于人类染色体9p12-13上，包含有21个外显子，20个内含子，整个基因长度约87kb，其中9个位于内含子区域（内含子5,8,10,12,15,17），4个位于基因编码区域（外显子1,9,13,15），共13个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP），其转录子的碱基数为4.6kb。RECK是互补DNA编码的膜锚定糖蛋白，其相对分子质量为110000，由971个氨基酸共同组成。NH2端和COOH端有2个疏水区域。在NH2端有5个半胱氨酸重复结构和5个潜在的糖基化位点，COOH端由疏水的糖蛋白I(glycoprotein，GPI)锚定信号固定于细胞膜。含有3个中心的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,SPI)区域，完全符合kazal模体。一个典型的Kazal结构域包含6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键，结构为1-5/2-4/3-6，目前描述的大多数Kazal域都属于这个类[5]。RECK可能在表观遗传、转录和转录后水平以及通过改变其在细胞表面的稳定性来发挥作用。通过启动子甲基化可以观察到RECK转录本和蛋白水平的下调[6]。RECK受致癌信号传导的抑制。Ras通过Sp1的磷酸化蛋白和癌基因,与组蛋白脱乙酰酶(HDAC)结合导致转录的Sp1位点抑制RECK[7]。RECK可能从中释放出来细胞膜溶蛋白裂解中释放出来，这种机制受到TGF-β信号传导的保护。RECK在正常组织中广泛表达，在组织发育、形态发生、重塑、组织结构、细胞迁移、细胞-细胞相互作用、软骨发生、肌生成、血管生成等方面具有多种功能[8]。

2 RECK抑制肿瘤侵袭与转移的机制

2.1 RECK与基质金属蛋白酶之间的关系

MMPs是锌/钙依赖的内肽酶，在不同的生物过程中需要对细胞外基质进行修饰，包括血管生成、组织重塑、胚胎发育、细胞迁移和形态发生等。在正常生理条件下大多数基质金属蛋白酶发挥(如干细胞分化、细胞增殖、细胞活性、ECM重塑、伤口愈合、血管生成、细胞凋亡)等核心作用，基质金属蛋白酶及其抑制剂之间的失衡是各种病理条件(肿瘤浸润、纤维化等)的基础，主要是与组织破坏和异常的ECM成分有关[9]，MMPs是一个大的酶家族，负责大多数ECM组分的降解和代谢，能够裂解纤维胶原。MMPs通过多种方式参与肿瘤细胞的体内行为：(1)直接切割基质结缔组织和基底膜成分，驱动侵袭和转移；(2)膜锚定生长因子或细胞因子及其受体的分裂或脱落；(3)分裂促凋亡因子，通过增加细胞存活、抗凋亡细胞诱导更具有侵袭性的表型；(4)肿瘤血管生成的双重功能，通过调动或激活促血管生成因子而促血管生成，或通过裂解大蛋白前体而产生血管生成抑制剂(血管抑素、内皮抑素、肿瘤抑素)而反血管生成；(5)细胞粘附分子的脱落，如钙粘蛋白、CD44等，导致emt细胞运动增强[10-14]，这些方面也见于骨转移性乳腺癌[15-16]。MMP在癌症研究中非常重要，因为MMP高表达和活性几乎与每一种人类和啮齿类癌症有关。它们还与肿瘤晚期、侵袭转移增加和生存时间缩短有关。RECK基因是基质金属蛋白酶抑制剂，具有独特的抑制基质金属蛋白酶的表达与活性的功能，转录后能抑制多种MMPS的表达如MMP2、MMP9、MT1-MMP等[17]，在RECK蛋白的中心有三个丝氨酸蛋白酶抑制剂样(SPI)域这些SPIs被认为通过物理诱捕或可逆的紧密结合来抑制蛋白酶活性。SPIs可能在抑制MMPs中发挥重要作用。在蛋白质的中间区域也有两个具有表皮生长因子样重复的区域。一个位点位于蛋白质序列的前三分之一;这是由5个具有特殊功能价值的半胱氨酸重复序列所标记的，以及在天门冬酰胺残基上包含几个糖基化位点。这些位点对于与RECK蛋白的核心功能MMP9和MMP2进行适当的相互作用至关重要[18]。

2.2 RECK与血管生成的关系

在肿瘤转移过程中，肿瘤需要具有诱导血管生成和侵袭性的能力。肿瘤血管生成是指随着肿瘤的增大，肿瘤细胞为生存需要而补充血管。侵袭性的定义是肿瘤通过穿透基底膜和其他ECM结构从原发部位逃逸。这意味着如果这些功能能够被抑制，肿瘤的生长将会停止。VEGF家族蛋白通常在内皮细胞中表达，由于其肝素结合特性，内皮细胞可自由溶解或与细胞表面和ECM结合。它们是血管生成的主要诱导因子，参与骨形成、造血、伤口愈合和发育等机体功能。在一项非小细胞肺癌的研究中，也研究了RECK抑制VEGF诱导的肿瘤血管生成的可能性。

3 RECK与头颈部鳞状细胞癌

3.1 RECK与口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）

Pramanik[19]等采用RT-PCR法检测11个正常样本、20个非侵袭性口腔鳞癌样本和9个侵略性口腔鳞癌样本中RECK mRNA的表达情况。与正常的RECK基因启动子样本相比，非侵袭性口腔鳞癌和侵袭性口腔鳞癌组织样本的高甲基化程度增加，年龄组＞40和＜70岁组RECK基因启动子甲基化呈上升趋势，RECK基因启动子的甲基化状态与邻近组织中RECK蛋白的表达呈负相关。RECK mRNA表达与RECK基因高甲基化相关，且显著负相关。Kato[20]等研究了绿茶中主要的多酚—（Epigallocatechin-3-gallate EGCG)对口腔鳞状细胞癌细胞系中RECK基因甲基化状态和肿瘤侵袭的影响。结果显示，EGCG治疗口腔癌细胞部分逆转了RECK基因的高甲基化状态，显著提高了RECK mRNA的表达水平。EGCG处理后，细胞中MMP-2和MMP-9水平也受到抑制。EGCG通过减少三维胶原侵袭模型中侵袭灶数量和侵袭深度，显著抑制了癌细胞的侵袭能力。提示EGCG可能是通过对RECK等MMP抑制剂的去甲基化作用从而抑制细胞侵袭。

赵文等[21]采用RT-PCR检测34例口腔鳞癌及癌旁组织中RECK的mRNA的表达情况，34例口腔鳞癌病症RECK mRNA表达量0.47±0.06，癌旁病灶RECK mRNA表达量为0.95±0.13，两者差异具有统计学意义（P＜0.05），这一结果提示RECK基因在口腔鳞癌中为低表达，且可能与口腔鳞癌的侵袭相关。Li[22]等采用免疫组化SP法检测RECK基因和MMP-9蛋白在60例口腔鳞癌及10例正常口腔黏膜组织中的表达，并分析与临床病理特征的关系。RECK蛋白在口腔鳞癌组织中的阳性表达率为51.67%，在正常口腔黏膜组织中的阳性表达率为90%，二者差异有统计学意义（P＜0.05),RECK和MMP-9蛋白表达呈负相关关系（r=-3.266,P＜0.05)。RECK和MMP-9蛋白在口腔鳞癌中的表达与病理分级、TNM分期及淋巴结转移有关。结果提示RECK基因可能是通过下调MMP-9蛋白的表达水平达到抑制口腔鳞癌的侵袭与转移。

3.2 RECK与中耳鳞状细胞癌

Liu等[23]采用免疫组化方法对30例中耳鳞状细胞癌组织和20例相邻正常外耳道皮肤组织进行RECK检测。中耳鳞状细胞癌中RECK表达阳性率明显低于正常外耳道皮肤。RECK的表达与肿瘤组织学分级和肿瘤分期有关，与患者年龄或性别无关。结果显示RECK参与了中耳鳞状细胞癌的发生发展，可作为评价中耳鳞状细胞癌进展和转移的标志物。

3.3 RECK与喉癌

Haoran等[24]选取41例喉癌组织和癌旁组织，喉息肉组织作为对照组，采用RT-PCR和WB法检测RECK mRNA及蛋白的表达情况，RECK喉癌组织的表达低于癌旁和息肉组织,其与MMP-14（r=-0.812,P=0.027）和VEGF（r=-0.907,P=0.013）呈负相关，其表达与病理分级、淋巴转移及临床分期有关（P＜0.05）；结果显示检测RECK基因对喉癌患者的诊断、转移及临床分期的确定具有重要意义。Jiangbo等[25]采用PV9000免疫组织化学两步法检测24例喉鳞癌组织及对应深部切缘组织中RECK蛋白的表达情况。结果显示RECK在喉癌组织中阳性表达率为42%,在不同距离(2,5,10,15 mm)深部切缘组织中阳性表达率分别为50%、58%、88%、96%。癌组织与10 mm处切缘组织比较,差异有统计学意义(P＜0.01),5 mm与10 mm处组织之间差异有统计学意义(P=0.014)。随着喉鳞癌分化程度的降低和临床分期从T1到T4的提高，RECK蛋白的阳性表达率呈明显下降趋势。提示RECK在喉癌中的高表达与喉鳞癌的侵袭转移、病理分化及临床分期有密切关系。10 mm的距离对于喉癌的黏膜下侵袭是可靠的，可以将其作为指导临床手术的安全切缘。Cui等[26]采用甲基化特异性PCR检测手术切除的喉鳞状细胞癌标本70例及正常喉黏膜标本15例的RECK基因甲基化情况，放疗6个周期，随访5年后发现，放疗敏感47例（67.14%），放疗不敏感23例（32.86%），放疗敏感组RECK基因甲基化水平低于放疗不敏感组（P＜0.05）；缓解组RECK基因甲基化水平低于未缓解组，RECK基因甲基化可使肿瘤未缓解的危险增高5.010倍。结果显示RECK基因启动子区甲基化是人喉鳞状细胞癌的早期事件，与患者的放疗敏感性和治疗效果具有重要关系，对放疗敏感和放疗效果具有提示和预测作用。

3.4 RECK与食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)

Zhu等[27]通过甲基化特异性PCR和定量PCR分析310对ESCC组织中RECK的甲基化状态和mRNA的表达水平。结果显示，在ESCCs中RECK基因平均甲基化指数(MI)为0.65，在非肿瘤样本中为0.49。RECK在ESCC组织中的mRNA表达水平低于非肿瘤组织，且RECK mRNA表达水平降低与ESCC淋巴结转移相关。此外，RECK基因高甲基化的ESCC患者的RECK mRNA水平与RECK基因低甲基化组比较是下降的，RECK mRNA表达水平和RECK基因甲基化指数与术后生存率低有显著相关性。研究结果提示启动子高甲基化可能是导致RECK mRNA表达缺失的重要因素，可能是ESCC生存不良的一个指标。Zhu等[28]采用RT-PCR和WB法检测40对ESCC组织中RECK的mRNA及蛋白水平的表达。结果显示，在食管鳞状细胞癌中RECK为低表达。RECK的表达与ESCC组织学分级、浸润深度和淋巴转移密切相关。研究表明，RECK是miR-16的靶点，miR-16过表达可以抑制ESCC细胞的凋亡。MiR-16通过结合RECK mRNA的3’UTR，下调TE-1和Eca-109细胞系中的RECK，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，在ESCC发病机制中发挥重要作用。

3.5 RECK与鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC)

Zhou等[29]通过免疫组化检测鼻咽癌组织60例，慢性鼻咽炎组织30例RECK蛋白的表达，发现鼻咽癌组织中RECK为低表达，其表达水平与鼻咽癌MMP9表达水平呈负相关，此外，RECK蛋白的异常表达与EBVCA-IgA滴度、淋巴转移、复发、存活均呈正相关。结果显示，RECK可能通过调节MMP9的表达参与鼻咽癌的肿瘤进展过程，可能是检测鼻咽癌的良好预后的指标。Deng等[30]采用原位杂交技术检测60例原发性NPC（颈淋巴结转移组和无颈淋巴结转移组各30例）、10例NPC颈部转移淋巴结（MLT）和20例慢性鼻咽炎组织（CNT）中RECK mRNA的表达情况，与CNT比较，NPC和MLT中RECK表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。NPC淋巴结转移组与无淋巴结转移组RECK差异有统计学意义（P＜0.05）。NPC中RECK异常表达与患者性别、年龄、T分期和临床分期无关，与颈淋巴结转移、复发和治疗后5年生存期有关，且二者表达呈负相关,结果提示RECK基因异常表达参与了NPC的侵袭转移过程，可能与NPC的进展有关。RECK可作为评估NPC颈淋巴转移、复发及预后的生物学参考指标。

4 展望

RECK基因的下调与头颈部鳞状细胞癌的侵袭、转移和血管生成直接相关。大量实验表明，RECK基因表达的高低与头颈部鳞状细胞癌[31]患者的预后有着密切的联系。而RECK基因是一项相对较新的发现，能否作为头颈部鳞状细胞癌早期诊断生物标志物和癌症患者延长生存期指标成为大家共同的研究目标。可能在不远的将来[32]，人们会看到依据RECK基因而设计的分子诊断和基因治疗应用于头颈部鳞状细胞癌的临床治疗。