不同烘干温度对甲壳类水产品中氨基脲检出量的影响

曹爱玲，陈怡琳，蔡路昀，曹敏杰，沈 立，侯寒黎

（1.钱江海关，浙江杭州 310007；2.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；3.浙江大学宁波研究院，浙江宁波 315100；4.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）

呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）是硝基呋喃类药物，其代谢产物氨基脲（semicarbazide，SEM）是一种联胺类小分子化合物，易与生物细胞膜蛋白结合生成稳定残留，具有潜在的致癌、致畸和致突变性[1-3]，长期摄入会对人体健康造成严重危害。1995 年，呋喃西林已被欧盟列入禁止在动物源食品中使用的药物[4]。我国于2002 年公布的《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》公告中也明令禁止呋喃西林用于食品动物的治疗[5]。呋喃西林作为一种广谱抗菌药，在动物体内会迅速代谢，故SEM 常被选定为检测呋喃西林药物残留的标志物。

目前，应用于检测动物源食品中SEM 含量的方法主要有高效液相色谱（HPLC）及其联用技术[6-7]和免疫分析法[8-9]两种。而应用于检测甲壳类水产品中SEM 含量的方法主要是高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）。黄宣运等[10]利用高效液相色谱-串联质谱法，检测分析出中华绒螯蟹在室外池塘自然养殖条件下的体内SEM 残留量及其消除规律。吴旭等[11]采用该法检测发现，在淮安地区的小龙虾养殖中仍存在违规使用呋喃西林药物的现象。宋蓓等[12]优化了高效液相色谱-串联质谱法，用以检测日本沼虾中的SEM 残留量，发现虾壳中的SEM 检出量最高，且以游离态形式存在；虾肉中的SEM 检出量最低，以结合态形式存在。

本研究按照国家标准GB/T 21311—2007[13]，以南美白对虾和中华鳖为检测对象，采用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，探究不同烘干温度对甲壳类水产品中SEM 检出量的影响，以期为后续更精确快速检测甲壳类水产品中的SEM 含量提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的南美白对虾和中华鳖：购买于杭州出境水生动物注册养殖场；SEM 标准物质：纯度≥99%；内标物13C15N-SEM：纯度≥99%；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷和甲酸：均为色谱纯；浓盐酸、氢氧化钠、邻硝基苯甲醛、三水磷酸钾、乙酸铵、尿素、乙磺酸（HEPES）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫苏糖醇（DTT）、TCA-丙酮和碘乙酰胺：均为分析纯。

万能高速粉碎机：欧凯莱芙（香港）实业公司；DHG-9055A 鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；QTRAP®5500 LC-MS/MS 系统：上海爱博才思分析仪器贸易有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱：美国沃特世公司。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准储备液 准确称取适量的SEM 标准品，用乙腈溶解并定容，配置成质量浓度为100 mg/L 的标准储备溶液，-18 ℃以下避光保存。

1.2.2 混合中间标准溶液 准确移取标准储备液1 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成质量浓度为1 mg/L 的混合中间标准溶液，4 ℃保存。

1.2.3 内标储备液 准确称取适量的13C15N-SEM内标物，用乙腈溶液定容并配置成质量浓度为100 mg/L 的标准储备溶液，-18 ℃以下避光保存。

1.2.4 混合内标标准溶液 准确移取内标储备液1 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容，配置成质量浓度为1 mg/L 的中间内标标准溶液；准确移取中间内标标准溶液0.1 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，配制成质量浓度为0.01 mg/L 的混合内标标准溶液，4 ℃下保存。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18，2.0 mm I.D.×150 mm，5 μm；柱温：30 ℃；流速：0.2 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸水溶液（含0.000 5 mol/L 乙酸铵）。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.2 串联质谱条件 离子源：电喷雾离子源；喷雾电压：3 500V；离子源温度：120 ℃；去溶剂温度：350 ℃；锥孔气流：氮气，流速100 L/h；去溶剂气流：氮气，流速600 L/h；碰撞气：氩气，碰撞气压2.6×10-4Pa；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）。监测条件见表2。

表2 多重反应监测（MRM）的条件

1.4 样品采集及制备

鲜活的南美白对虾和中华鳖样品，取自杭州出境水生动物注册养殖场，整个饲养周期都不添加呋喃西林。样品低温运至实验室后，在-80 ℃的超低温保存箱中冷冻保存。检测分析前，将样品解冻至室温。对南美白对虾样品，将去头胸甲的头部组织与虾壳和虾肉分剥开，均匀分成3 份，分别在70、100、130 ℃温度条件下烘干48 h，再用粉碎机粉碎（虾肉90 s、虾壳150 s）；对中华鳖样品，取鳖肉和鳖壳部分，均匀分成3 份，烘干温度处理与南美白对虾相同，用粉碎机粉碎（鳖肉90 s、鳖壳10 min）。

1.5 样品前处理

1.5.1 水解和衍生化 将2 g 烘干粉碎后的样品（精确至0.01 g）放入50 mL 离心管中，然后加入10 mL 的甲醇-水混合溶液，振荡10 min，4 000 r/min离心5min，弃上清液；加入10 mL 0.2 mol/L 盐酸至残留物中，10 000 r/min 均质1 min；依次加入100 μL 混合内标标准溶液、100 μL 邻硝基苯甲醛溶液，涡动混合30 s、振荡30 min，最后置于37 ℃恒温箱中避光反应16 h。

1.5.2 提取和净化 取出离心管冷却至室温，加入1 mL 0.3 mol/L 磷酸钾溶液混匀；用2.0 mol/L 氢氧化钠调至pH7.2～7.6，振荡提取10 min，10 000 r/min 离心10 min；用Oasis HLB 固相萃取柱净化，控制样液以2 mL/min 流速通过Oasis HLB 柱；用10 mL 乙酸乙酯洗脱固相萃取柱于50 mL 离心管中，用氮气在40 ℃下吹干；加入1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，用3 mL 乙腈饱和的正己烷，分两次进行液液分配；取下层溶液过0.2 μm 微孔滤膜，取10 μL 供高效液相色谱-串联质谱测定。

1.5.3 混合基质标准溶液制备 取5份阴性样品，每份约2 g（精确至0.01 g），放入50 mL 离心管中，按1.5.1 洗样后，分别加入100 μL 混合中间标准溶液、100 μL 混合内标标准溶液，之后按1.5.2 进行衍生、提取和净化，配置成最终定容浓度梯度为1、5、10、50、100 ng/mL 的混合基质标准溶液。

1.6 数据处理

按公式（1）自动计算样品中SEM 的浓度，计算结果扣除空白值。

式中：X为样品中SEM 的检出量（μg/kg）；R为样液中的SEM 与12C15N-SEM 峰面积比值；c为混合基质标准溶液中SEM 的浓度（ng/mL）；V为样液最终定容体积（mL）；Rs为混合基质标准溶液中的SEM 与12C15N-SEM 峰面积比值；m为样品质量（g）。

采用Excel 2010 对上述计算所得数据进行统计和分析。

1.7 蛋白含量测定

为探究不同烘干温度下部分蛋白质受热分解对SEM 检出量的影响，采用考马斯亮蓝法（Bradford法），选取中华鳖壳样品进行蛋白质定量测定。称取0.21 g 烘干粉碎后的中华鳖壳样品放入试管中，加入少量裂解液Buffer（由8 mol/L 尿素、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA 和10 mmol/L DTT 配制而成），20 000g，4 ℃下离心30 min；取上清液，往其中加入4 倍体积预冷后的TCA-丙酮，-20 ℃条件下沉淀2 h，20 000g，4 ℃条件下离心30 min；加入3 倍体积的纯丙酮，-20 ℃条件下沉淀20 min，20 000g，4 ℃条件下离心30 min。重复此操作3 次，清洗沉淀。往沉淀中加入裂解液Buffer，在pulse on 2 s，pulse off 3 s，power 180 w 超声条件下，超声5 min助溶，20 000g，4 ℃条件下离心30 min；取上清液，往上清液中加入DTT 至终浓度为10 mmol/L，56 ℃条件下水浴1 h；取出溶液后，迅速加入碘乙酰胺至终浓度为55 mmol/L；于暗室静置1 h 后，采用Bradford 法，对中华鳖壳中的蛋白进行定量，用系列蛋白浓度绘制蛋白质标准曲线来测定蛋白质含量。

1.8 数据分析

采用Excel 2010、SAS 和SPSS 软件，对数据进行统计处理和分析，部分结果用平均值±标准方差表示。

2 结果与分析

2.1 不同烘干温度下的SEM 检出量

分别取4 份虾和鳖的壳与肉组织（空白对照1 份、试验3 份），置于70、100、130 ℃下烘干48 h；研磨成粉后，按照国家标准GB/T 21311—2007[13]，采用高效液相色谱-串联质谱法，对每份试样中的SEM 进行平行检测。结果（表3）显示：烘干前，虾肉中的SEM 检出量明显高于虾壳中的（P＜0.05），但鳖肉和鳖壳中的SEM 检出量几乎一致，均＜0.5 μg/kg；随着烘干温度的升高，各种样品中的SEM 检出量均不断上升，不同烘干温度下的SEM 检出量均存在显著性差异（P＜0.05）；相同烘干温度条件下，虾样品中的SEM 检出量明显高于鳖样品（P＜0.05），虾肉和鳖肉的SEM 检出量间普遍高于相对应的虾壳和鳖壳。

表3 不同烘干温度下的SEM 检出量 单位：μg/kg

2.2 不同烘干温度下中华鳖壳中的蛋白含量

采用Bradford 法对中华鳖壳中所含蛋白进行定量检测分析，用系列浓度蛋白绘制蛋白质标准曲线，得到的回归曲线方程为y=0.114 8x+0.005 2，R2=0.994 7（图1），发现随烘干温度升高，鳖壳中的蛋白含量逐渐下降，其中70 ℃和100 ℃烘干条件下的蛋白含量存在显著性差异（P＜0.05），而100 ℃与130 ℃差异不显著（P＞0.05）。具体结果见表4。

图1 蛋白质标准曲线

表4 不同烘干温度下中华鳖壳中蛋白含量

3 讨论

试验用品南美白对虾与中华鳖在前期饲养阶段均未添加使用呋喃西林药物，因此研究检测出的SEM 为内源性。检测发现，不同烘干温度下，各样品中的SEM 检出量与温度呈正比，随着温度梯度升高，SEM 检出量明显增加。检测还发现，壳中的SEM 检出量普遍高于肉中检出量，这与吴旭等[11]对淮安地区小龙虾，宋蓓等[12]对日本沼虾，McCracken 等[14]对孟加拉国淡水明虾，Poucke 等[15]对罗氏沼虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、挪威海蟹虾、锯缘青蟹和远海梭子蟹，彭婕等[16]对中华绒螯蟹，闻声等[17]对湖北地区虾中各部分的SEM 含量检测结果相一致。

对不同烘干温度下的中华鳖壳蛋白含量进行检测发现，随着烘干温度的升高，壳中的蛋白含量在逐渐减少，说明蛋白质因受热而逐渐分解。而在蛋白质受热分解过程中可能会产生SEM，使SEM 检出量增加[18]。当然，随着烘干温度的提高，样品得到浓缩，也会导致一定的程度的SEM 含量增加。因此，今后在进行甲壳类水产品中SEM 含量检测时，对受检样品烘干处理的温度不能高于70℃；在前期提取和净化过程中，使用氮气吹干时温度应当控制在40℃，高效液相检测过程中的柱温箱温度应当控制在30℃，避免出现高温波动，导致受检样品中的部分蛋白受热分解产生SEM，影响SEM 检出量。

4 结论

研究发现：烘干温度对甲壳类水产品中的SEM 检出量有较大影响，随着烘干温度的升高，部分蛋白质受热分解会产生SEM，导致SEM 检出量增加；同一甲壳类水产品中，壳中的SEM 检出量普遍高于肉中的检出量。因此，在检测甲壳类水产品中的SEM 含量时，对受检样品的烘干温度要控制在70 ℃以下，并且要选择合适的检测样品种类。本研究探明了烘干温度与SEM 检出量的关系、SEM 易残留的部位以及引起检出量增加的原因，为后续更精确快速检测甲壳类水产品中的SEM 含量提供了依据。